– MOLSYBEN

1-Contexte scientifique et objectifs du projet : - Les mitochondries jouent un rôle déterminant dans le métabolisme énergétique. Le milieu cellulaire des muscles est hautement organisé et des macromolécules et organelles, dont les mitochondries, sont impliquées dans de nombreuses interactions structurelles et fonctionnelles. Le paradigme moderne de métabolisme cellulaire repose sur la compartimentation enzymatique, la compartimentation, la microcompartimentation et la canalisation de molécules régulatrices et de métabolites comme le calcium et l'ATP. Une nouvelle aire de recherche en développement, la bioénergétique moléculaire des systèmes, combine la modélisation mathématique et des approches expérimentales pour effectuer des études des systèmes métaboliques intégrés. - L'objectif principal du projet consiste à quantifier et modéliser la compartimentation hétérogène des nucléotides adényliques et les régulations intracellulaires complexes entre les mitochondries et les autres structures cellulaires dans des cellules normales. - - 2-Description du projet, méthodologie : - - Sur la base des résultats expérimentaux, un modèle complet de diffusion-réaction des réactions mitochondriales et des processus de transfert d'énergie entre différents compartiments des cellules musculaires sera établi. Le modèle de transfert d'énergie tiendra compte des réseaux couplés de créatine kinase et d'adényl kinase, et les processus de diffusion. Les expériences seront menées sur des cardiomyocytes de rat, des cellules HL-1 battantes ou non, des synaptosomes isolés et des mitochondries. L'oxygraphie, la chromatographie liquide à haute pression et la spectrophotométrie seront utilisés pour déterminer la régulation de la respiration. La microscopie confocale et les techniques de bioluminescence, de spectroscopie de corrélation fluorescence, et les transferts résonnants d'énergie (FRET) permettront de déterminer les paramètres de diffusion des nucléotides adényliques entre les compartiments cellulaires, avec l'analyse quantitative par des modèles mathématiques. Le rôle possible du mouvement des mitochondries sera étudié. Les concentrations locales d'ATP sera mesuré sur des cellules HL-1 grâce à l'utilisation de formes recombinantes de luciférase sensible à l'ATP et exprimée dans différents compartiments : dans la matrice mitochondriale ; sur la face externe de la matrice ; entre le transporteur mitochondrial d'ATP (ANT) et la créatine kinase mitochondriale (MtCK) ; dans les myofibrilles en connection avec les molécules de myosine de la bande A ; à la membrane du réticulum sarcoplasmique, dans le voisinage des canaux K ATP sous le sarcolemme, dans les différents états des réseaux de transfert d'énergie (intact, inhibé, protéine invalidée : knock-out ). Le couplage fonctionnel direct et la canalisation des substrats entre l'ANT et la MtCK, et entre les canaux K ATP et la créatine kinase cytosolique seront étudiés à l'aide de la technique de FRET sur des analogues fluorescents. - 3-Résultats attendus : - Un modèle de la compartimentation hétérogène des nucléotides adényliques et les communications fonctionnelles et structurelles complexes entre les mitochondries et les autres structures cellulaires dans des cellules normales sera établi à fins d'utilisation pratique. Les concentrations locales de nucléotides adényliques seront mesurées dans différents points de la cellule. Les mécanismes de couplage fonctionnel des complexes multi-enzymes seront caractérisés. Ces méthodes quantitatives seront utilisées pour estimer les états pathologiques de la cellule, comme l'ischémie et les méthodes de protection cardiaque. - - ...