– MacroTET

Dans le cytoplasme, les complexes protéolytiques géants sont essentiels pour maintenir l'intégrité des systèmes en éliminant spécifiquement les protéines déficientes. Ces complexes protéases sont ainsi très impliqués dans les réponses aux stress, le vieillissement ainsi que dans les maladies dégénératives. De plus, il est à présent clair que beaucoup de processus cellulaires clé (cycle cellulaire, changement métaboliques..) sont directement contrôlés via la destruction sélective de facteurs de régulations. Dans ce contexte, la caractérisation de nouveaux grands systèmes de protéolyse représente un champ de recherche important en Biologie. - - Du fait de leur position dans l'évolution, leur adaptation aux environnements hyper hostiles et leurs propriétés biochimiques, les Archaea extrêmophiles sont d'excellents modèles pour caractériser des grands édifices de protéolyse, possiblement conservés dans d'autres types cellulaires.Les protéases TET d'Archaea ont été recement identifiées et caractérisées dans notre groupe. Les protéines s'auto-assemblent en grandes structures géométriques creuses et auto compartimentalisées (tétraèdre de 12ssu ou octaèdres de 24ssu) pour détruire les polypeptides. Les TET protéases sont très répandues dans les génomes d'Archaea, de bactéries et des homologues existent dans les génomes eucaryotes. Du fait de leurs caractéristiques uniques, les protéases TET sont probablement des acteurs importants dans la protéolyse cellulaire. Il est possible que ces complexes appartiennent au chemin de dégradation du proteasome. Toutefois, plusieurs résultats de notre laboratoire indiquent que TET pourrait être le socle d'un nouveau chemin de dégradation. - - Les objectifs du projet sont d'élucider le(s) rôle(s) du système TET dans les cellules et de fournir la première description du fonctionnement d'un nouveau type de machine moléculaire. - - Le projet est interdisciplinaire et combine des études cellulaires et biochimiques originales avec des approches nouvelles en biologie structurale. - - - Des cellules de Haloferax volcanii génétiquement modifiées (inactivation de gènes, transgenèse..) seront étudiées pour comprendre l'importance du système TET dans le fonction de protéolyse et dans l'adaptation cellulaire aux stress. Le postionnement de TET par rapport aux voies de degradation du protéasome sera spécifiquement examinés a travers l'utilisation de systèmes rapporteurs GFP. Des experiences de pulldown seront utilisées pour confirmer l'identité de proteines que nous proposons comme partenaires de TET. Ces proteins co-purifient avec TET et sont des proétases ou des chaperones putatives. Les genes correspondants chez l'Archaea marine abyssale hyperthermophile Pyrococcus horikoshiiseront clones et exprimés chez E. coli. Mles activités proteases et chaperon de ces proteins seront caractérisées et leur capacité à interagir physiquement et fonctionnellment avec le compelxe TET sera testé in vitro. Ces complexes seron produits et leurs structures seront résolues en combinant la cristallographie des proteines, la cryoMicroscopie electronique et des experiences de dffusion de neutrons (SANS) ou de rayons X (SAXS). - - Les 4 protéases TET de P. horikoshii ont des spécificités de substrat différentes. Leurs caractéristiques enzymatiques et structurales respectives indiquent que les complexes TET sont des machines moléculaires capables de s'assembler en paricules hétéro oligomèrique, probablement pour fonctionner de façon cooperative au sein d'un meme nanocompartiment cellulaire. Pour verifier ce modèle, les différents assemblages TET (homo et hétéro oligomèriques) seront produits à partir de proteins recombinantes ou purifiées sous leur forme native à partir de pâte cellulaire de P. horikoshii. Les propriétés enzymatiques des différents complexes TET seront caractérisées. Leurs structures seront résolues par CryoEM, SANS et crystallographie. Des mutants de TET seront produits pour caractériser les relations s