– INMEMBRANE

Notre objectif est d'étudier l'interactome membranaire bactérien par une approche originale évitant l'utilisation de détergents afin de comprendre la structure et la dynamique des complexes de protéines membranaires. Cet aspect de la biologie membranaire est d'importance primordiale dans beaucoup d'aspects de la vie de la cellule tels que le transfert de signaux et la capture d'énergie photosynthétique pour n'en citer que deux, où la dynamique et la structure des complexes multi protéiques de membrane déterminent leur fonction. Il est devenu évident que les protéines ne sont pas présentes dans la cellule comme une soupe désorganisée mais sont en fait organisées en structures hiérarchiques organisées à plusieurs niveaux. Ceci doit s'appliquer bien évidemment aux membranes où les protéines sont regroupées dans des super complexes nanométriques et dynamiques qui sont localisés eux-mêmes dans des domaines membranaires spécifiques. Plusieurs de ces structures complexes sont capables de s'assembler et de se désassembler en réponse à des changements dans l'environnement. Bien que cette organisation complexe et dynamique soit bien admise, elle est cependant mal comprise jusqu'ici. Nous ne connaissons pas actuellement les structures des complexes de protéines membranaires, ni leur composition exacte ou leur dynamique. Dans ce projet, nous proposons d'étudier l'organisation de ces domaines spécialisés de membrane afin d'élucider leur composition, leur structure, et leur fonction. Pour atteindre nos objectifs, nous proposons une combinaison innovante de techniques pour isoler et analyser les complexes de protéines membranaires. Le projet se base sur le postulat que les études systématiques des protéines de membrane doivent éviter l'utilisation des détergents puisque ceux-ci perturbent les complexes que nous souhaitons étudier. En associant une destruction physique des cellules et l'utilisation d'une purification par affinité basée sur des protéines de membrane étiquetées et exprimées à leur niveau physiologique, nous proposons d'étudier la composition des complexes protéiques membranaires. Pour l'identification des protéines, nous nous basons sur la puissance des analyses modernes de spectrométrie de masse que nous adapterons spécifiquement à l'étude des protéines de membrane. Cette approche innovante de purification de complexes membranaires sera validée sur des complexes bien connus comme les systèmes de chemosenseurs Tsr-Tar. Nous nous appliquerons alors à élucider l'organisation membranaire des enzymes de synthèse des phospholipides et celle du complexe de Tol/Pal. Nous caractériserons également la structure des complexes fonctionnels que nous identifierons durant l'étude. En outre, nous proposons de coupler cette approche de purification avec l'utilisation de domaines auto fluorescents afin de visualiser la localisation et la dynamique in vivo des complexes membranaires. La purification directe de fragments de membrane est particulièrement intéressante car elle permettra l'isolement de complexes biologiques qui pourront plus tard être employés pour des études fonctionnelles et structurales. Nous souhaitons valider ce système et illustrer sa puissance sur quelques systèmes que nous connaissons bien avant d'étendre l'étude à d'autres systèmes de types différents. Nous nous concentrerons au départ sur les protéines de la membrane interne de E. coli en raison de la facilité des manipulations de biologie moléculaire et de biochimie sur cet organisme. Cependant, ceci est envisagé comme prélude à l'étude d'autres systèmes plus complexes comme les machineries de sécrétion de la bactérie pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa, la membrane externe des bactéries Gram négatives, et diverses membranes de cellules eucaryotes. Afin de mener à bien ce projet, nous avons choisi de rassembler une équipe transversale composée de chercheurs de notre laboratoire intéressés et experts à divers niveaux du projet. En particulier, James Sturgis, chef du projet, est intéressé par les principes fondamentaux de l'organisation des protéines de membrane et apporte l'expertise sur la biophysique et la bioinformatique. Emmanuelle Bouveret est intéressée par l'organisation supramoléculaire des machineries de biosynthèse des lipides dans les bactéries et apporte l'expertise de biologie moléculaire et des techniques d'étude des interactions protéine-protéine. En résumé, nous proposons une approche révolutionnaire d'étude des complexes membranaires. Nous sommes convaincus que cette approche apportera une méthodologie effective pour l'étude de l'interactome membranaire, au niveau structural et fonctionnel.