– CRUMBS

L'acquisition de la polarité cellulaire et la formation des premières couches épithéliales a été une étape cruciale lors du développement des premiers organismes multicellulaires d'origine animale. La formation d'un axe apico-basal et de complexes de jonctions séparant le domaine apical du domaine latéral nécessite la coordination de l'action de plusieurs complexes protéiques appelés complexe de polarité. Ces complexes sont au moins au nombre de 3 et notre projet va porter sur l'un de ces complexes, le complexe Crumbs. Nous avons, au cours des dernières années, caractérisé ce complexe chez les mammifères et montré qu'il se compose d'une protéine transmembranaire CRB3 et de 2 adaptateurs cytosoliques, Pals1 et Par6, eux-mêmes connectés à d'autres protéines adaptatrices ou portant des fonctions de kinases (PATJ, aPKC, Par3). Dans les cellules épithéliales de mammifères en culture, CRB3 et ses partenaires sont essentiels pour la formation des jonctions serrées et les phénotypes observés lors de sur-expression ou de déplétion laissent penser que ce complexe est impliqué dans plusieurs mécanismes cellulaires. Parmi ces fonctions cellulaires, il est vraisemblable que le complexe CRB3 régule le trafic membranaire (exocytose ou endocytose) au niveau apical, stabilise le cytosquelette et certains composants des jonctions serrées, contrôle la formation du cil primaire apical et intervient dans des cascades de signalisation en amont de la voie apoptotique. Ces fonctions semblent conservées chez la drosophile et un lien entre ces deux modèles sera très fécond pour mieux comprendre les mécanismes par lesquels agissent les complexes de polarité. Notre projet est de mettre à jour les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation des cellules épithéliales de mammifères et, pour cela, nous disséquerons les différents rôles du complexe CRB3 dans la morphogenèse épithéliale. Nous étudierons le transport et l'assemblage du complexe CRB3 car des régulations importantes ayant des conséquences sur la fonction de CRB3 semblent prendre place lors de son transport après biosynthèse. De plus, puisque CRB3 s'associe soit à Pals1 soit à Par6 il est important de comprendre où se forment ces associations et quelles en peuvent être les conséquences. Nous rechercherons le rôle précis de CRB3 dans le trafic l'exocytose et dans l'endocytose apicale grâce à l'obtention de lignées de cellules épithéliales Caco2 déplétées en CRB3 de façon inductible. CRB3 joue un rôle morphogénétique nouvellement décrit dans la formation du cil primaire, un organelle qui a une grande importance dans le développement normal des vertébrés et dans la physiologie des cellules épithéliales. De plus nous avons identifié au moins deux partenaires du complexe CRB3 qui ont un lien direct avec le cil primaire (Hook2 et TSC2). Pour comprendre ce rôle nous utiliserons des cellules ciliées en culture (ARPE19 et HK2) et une combinaison de shRNA inductibles, de marqueurs fluorescents du cil et des techniques live-imaging par microscopie confocale ultra-rapide. Enfin, par des approches nouvelles de cribles avec siRNA sur des cellules épithéliales humaines nous voulons identifier des gènes qui seraient des régulateurs négatifs de l'organisation épithéliale alors que la plupart des complexes identifiés à ce jour par la génétique sont des régulateurs positifs. Pour cela nous mettons au point un crible avec des cellules qui sont organisées de façon imparfaite et nous rechercherons des cibles qui lorsqu'elles sont down-régulées provoquent une meilleure organisation épithéliale. Nous avons déjà identifié une telle cible et nous allons caractériser son mode d'action par analyse transcriptomique. Afin de mieux appréhender la complexité des interactions entre les complexes de polarité nous utiliserons les ressources de la bio-informatique pour modéliser les réseaux d'interaction et découvrir de nouveaux candidats pouvant jouer un rôle dans l'organisation épithéliale. Une approche itérative entre la bio-informatique et les expériences sera entreprise afin d'affiner les modèles prédictifs d'interactions fonctionnelles.