– CELL REPROG

Le destin ordinaire d'une cellule est la différenciation avec la restriction progressive de ses potentialités, puis la sénescence. La différenciation et la sénescence sont deux processus caractérisés par des remaniements important de l'organisation chromatinienne et de la réplication. La transplantation nucléaire d'une cellule somatique (SCNT) a démontré de manière irréfutable que la différenciation cellulaire était un processus réversible via des facteurs présents dans le cytoplasme ovocytaire. Ainsi, la reprogrammation se retrouverait au centre de deux enjeux médicaux majeurs : (1) la dédifférenciation de toute cellule adulte pour pouvoir produire des cellules médicament, (2) rajeunir des cellules sénescentes dans des organes prématurément âgés. Des stratégies alternatives au SCNT ont montré des résultats très encourageants dans le domaine de la reprogrammation cellulaire. Des cellules somatiques peuvent être perméabilisées pour permettre l'accès à des extraits d'œufs de xénope ou des extraits de cellules souches embryonnaires. Dans ces conditions, Lemaitre et collaborateurs ont récemment montré qu'un remodelage mitotique préalable est essentiel pour permettre la réplication de l'ADN d'une cellule différenciée reprogrammée, et donc sans doute pour la dédifférenciation vers un état de cellule souche pluripotente et proliférante. Une autre stratégie est l'expression simultanée de plusieurs facteurs de transcription clés (OCT3/4, SOX2, CMYC and KLF4) pour dédifférencier des fibroblastes murins embryonnaires ou adultes en cellules souches pluripotentes. Ces résultats n'ont pas encore été reproduits dans des cellules humaines à ce jour. - Notre but est de développer et d'évaluer ces stratégies pour modifier le destin d'une cellule différenciée humaine. Nous étudierons le fibroblaste humain, modèle classique de cellule somatique différenciée. Nos objectifs sont : (1) dédifférencier des fibroblastes humains vers un état de pluripotence (Equipe De Vos) (2) inverser le processus de sénescence (Equipe Lemaitre), Nous reprogrammerons dans ce but des fibroblastes humains jeunes ou sénescents soit avec des extraits de cellules souches embryonnaires, soit par expression de certains facteurs de transcription humains par vecteurs lentiviraux. Nous évaluerons l'ampleur de la reprogrammation tout d'abord sur l'aspect morphologique, les capacités de croissance, par immunofluorescence, par cytométrie de flux ou par Q RT-PCR. Une méthode de sélection basée sur l'expression de la EGFP ou d'une cassette neo sous le contrôle du promoteur humain de POU5F1/OCT4 permettra également de détecter des cellules reprogrammée vers un état de pluripotence lorsque de tels événements sont rares. Les fibroblastes reprogrammés selon les critères énumérés ci-dessus seront analysés plus en détail par étude du transcriptome à haute résolution (puces Exon ST 1.0), par étude de la réplication de l'ADN par peignage de l'ADN, par étude des modifications de la chromatine par ChIP chip et finalement par étude de leurs capacités de différenciation. Pour les fibroblastes sénescents, nous étudierons en outre si la reprogrammation cellulaire a effacé les marques de sénescence. Finalement, nous identifierons quelle fraction des extraits cellulaires est responsable de la reprogrammation (Equipe Lehmann). - Ce projet est basé sur nos compétences complémentaires dans la biologie des cellules souches, en particulier les cellules souches embryonnaires humaines, la reprogrammation de cellules perméabilisées par extraits cellulaires, la construction et la production de vecteurs lentiviraux, l'analyse du transcriptome, la réplication de l'ADN et la protéomique. Nos trois équipes font partie de trois très grands instituts de recherche (Institut de Génomique Fonctionnelle, Institut de Génétique Humaine et Institut de Recherche en Biothérapie) et notre projet bénéficiera des très diverses expertises et plateformes disponibles dans ces instituts. Nous disposons de données préliminaires