Analyse de nouvelles fonctions de la nucléoline in vivo – NUCLEOLIN

Depuis plus de trente ans, la nucléoline, protéine majoritaire du nucléole, a été l'objet de nombreuses études qui l'ont impliqué dans un grand nombre de processus cellulaires. Cependant, sa localisation majoritaire dans les nucléoles semble présager un rôle important pour la biogenèse des ribosomes. De nombreux travaux ont ainsi pu mettre en évidence une implication de la nucléoline dans la régulation de la transcription par la RNA polymérase I et dans la maturation de l'ARN pré ribosomique. Des résultats récents montrent aussi qu'elle possède une activité histone chaperonne et qu'elle est capable de moduler la dynamique de la chromatine, ce qui pourrait expliquer, en partie, son rôle dans la régulation de la transcription. Malgré ces très nombreuses études, le rôle de la nucléoline dans ces multiples fonctions n'est pas encore complètement compris. La plupart des résultats expérimentaux ont été obtenus in vitro, et il est souvent encore plus difficile de conclure pour les études in vivo. En effet, comme la nucléoline semble être impliquée dans un grand nombre de processus, et il est donc difficile de savoir si ce que l'on observe est du à l'action direct de la nucléoline ou à un effet secondaire. La nucléoline possède plusieurs domaines qui doivent être impliqués dans des fonctions bien précises. Le domaine central qui contient des motifs de liaison à l'ARN (RBD) qui a été bien caractérisé. Il permet la liaison spécifique de la nucléoline à des séquences ARN retrouvées dans les ARN ribosomiques. Le domaine C-terminal (RGG) permet l'interaction avec d'autres protéines, permettant sans doute l'assemblage de complexes. Enfin, le domaine N-terminal, riche en acides aminés acides est le site de phosphorylation. Ce domaine est nécessaire pour l'activité chaperonne de la nucléoline, et permet sans doute de régulation la fonction de la nucléoline au cours du cycle cellulaire. Une étude plus approfondie de la fonction de la nucléoline in vivo nécessite la mise au point de nouveaux systèmes expérimentaux permettant de découpler les différentes fonctions et d'étudier en détail le rôle de chacun des domaines de la nucléoline. Nous avons mis au point 2 systèmes permettant cette étude : un KO conditionnel de la nucléoline dans les cellules DT40, et la transfection transitoire de siRNA dans des cellules humaines. Des résultats préliminaires avec ces deux systèmes expérimentaux ont montré non seulement que la nucléoline est une protéine essentielle pour la prolifération cellulaire, mais aussi que l'absence de nucléoline entraîne une dérégulation de la duplication des centrosomes analogue a ce qui été observé précédemment avec l'inactivation de la protéine nucléolaire B23. Nous proposons dans ce projet d'utiliser ces systèmes expérimentaux afin d'étudier le rôle de la nucléoline dans la structure et la dynamique de la chromatine, la régulation de l'expression des gènes (transcrits par la RNA polymérase I et II), la progression du cycle cellulaire et dans le contrôle de la duplication des centrosomes. Enfin, nous utiliserons le système de KO conditionnel de la nucléoline dans les cellules DT40 afin d'étudier les rôles des différents domaines de la nucléoline. Nous étudierons en particulier le rôle des domaines acides et des sites de phosphorylations du domaine N-terminal, des domaines de liaisons à l'ARN du domaine central et du domaine RGG C-terminal dans la viabilité, la prolifération et le contrôle du cycle cellulaire, la structure du nucléole et le contrôle de la duplication des centrosomes. En conclusion, nous somme convaincu que ce modèle des cellules DT40 sera très utile pour déterminer le rôle de la nucléoline in vivo, et le rôle précis de chaque domaine de la nucléoline dans chaque processus. Cette étude structure fonction est particulièrement importante car la nucléoline est actuellement une cible pharmacologique pour le traitement de cancer : cette étude pourrait aider a élaborer des stratégies pour inhiber une fonction particulière de la nucléoline.