– Xist A-repeat

La compensation de dose des gènes du chromosome X entre les femelles et les males est assurée chez les Mammifères par l'extinction transcriptionnelle d'un des deux chromosomes X des cellules de l'embryon femelle. Une étape déterminante du processus d'inactivation consiste en un recouvrement du chromosome X par l'ARN nucléaire non-codant Xist. Par ailleurs l'inactivation du chromosome X dépend d'échanges d'information entre les deux chromosomes X et entre chromosome X et autosomes. Le processus de comptage évalue le rapport X/autosomes et contrôle la décision d'initier (XX) ou non (XY) l'inactivation. Un processus de choix permet l'assignation mutuellement exclusive d'un chromosome X actif et d'un chromosome X inactif dans chaque cellule femelle. Une région spécifique du chromosome X, le centre d'inactivation (Xic pour X inactivation center), contient le gène Xist et assure la régulation de ces phénomènes. L'accumulation de l'ARN Xist sur le chromosome X choisi pour être inactif résulte en une hétérochromatinisation par l'intermédiaire du recrutement de complexes protéiques assurant cette fonction. La répétition A, un élément de 420 nucléotides constituté de 8-9 motifs répétés dont la séquence est conservée chez les Mammifères et qui est situé en 5' de l'ARN Xist, est indispensable pour la mise en place de l'extinction transcriptionnelle. La répétition A n'est pas nécessaire pour l'accumulation de l'ARN Xist sur le futur X inactif, mais elle est impliquée dans le repositionnement des genes de l'X dans le territoire de silence transcriptionnel induit par l'accumulation de Xist au sein du noyau. Ce projet a pour but l'élucidation des mécanismes moléculaires associés à la répétition A selon des approches structurales, biochimiques et génétiques grace à la collaboration de trois laboratoires aux spécialités complémentaires : P. Avner (l'inactivation du chromosome X), C. Branlant (ARN et RNP), et A. Van Dorsellaer (protéomique). Les études encore non-publiées du laboratoire C. Branlant ont permis de définir expérimentalement la structure 2D adoptée in vitro par la répétition A tant chez l'homme que chez la souris. Ces résultats établissent que des appariements sont mis en place entre unités conservées et non pas à l'intérieur de chaque unité conservée, comme le suggérait un modèle précédant. La connaissance de la structure secondaire de la répétition A constitue une base conceptuelle déterminante pour l'élucidation par mutagénèse de la fonction de la répétion A. Nous proposons d'établir une série de plusieurs mutations de la répétition A au site endogène du gène Xist dans des cellules ES femelles de souris par recombinaison homologue et remplacement de cassette médié par la recombinase site-spécifique cre. Les cellules ES femelles inactivent un chromosome X apres différenciation in vitro. Il sera ainsi possible d'analyser les effets de ces mutations de la répétition A dans plusieurs aspects de l'inactivation du chromosome X allant de la régulation du gène Xist, du métabolisme de l'ARN Xist, jusqu'aux processus de choix, d'extinction transcriptionnelle, de modification des histones et d'organisation nucléaire. Il est probable que la fonction de la répétition A résulte au moins en partie de l'établissement de complexes protéiques. Nous proposons d'identifier les partenaires protéiques de la répétition A et d'évaluer leur importance fonctionnelle. Nous avons mis au point une approche basée sur le système MS2 et permettant la purification de protéines d'extraits nucléaires capables d'interagir avec la répétion A. Les protéines ainsi purifées à partir d'extraits nucléaires de cellules ES avant et en cours de différentiation seront identifiées par spectrographie de masse. Le classement par ordre d'intérêt des candidats sera réalisé en fonction de la richesse de leur enrichissement par rapport à des controles où la répétition A sera absente ou mutée. Cet aspect quantitatif sera évalué par Western blot avec des anticorps disponibles ou apres expression de protéines « taggées ». L'association de ces protéines avec l'ARN Xist endogène sera confirmée par des expériences d'immuno-précipitation et RT-PCR quantitative. L'enrichissement de ces protéines candidates sur le chromosome X inactif sera évalué par immuno-RNA FISH. L'évaluation de l'importance fonctionnelle des meilleurs candidats sera réalisée par des expériences d'interférence par ARN dans le modèle des cellules ES. Les modalités de l'interaction de ces protéines avec la répétition A seront déterminées biochimiquement.