– TBPprolif

La protéine TBP (TATA-binding protein) joue un rôle central dans l'initiation de la transcription. TBP a une structure bipartite avec un domaine C-terminal très conservé. Ce domaine se replie comme un selle à cheval et interagit avec l'ADN par sa surface concave et avec les facteurs généraux de transcription (GTFs) et tout une série d'autres facteurs régulateurs par sa surface convexe. TBP forme plusieurs complexes avec des ensembles uniques de TAFs (TBP-associated factors) nécessaires pour la transcription par les ARN polymérases (pol) I, II et III. Des expériences génétiques indiquent également un rôle de TBP dans la régulation de la prolifération. La capacité de TBP à interagir avec de multiples partenaires à inspiré une série d'études visant à identifier les surfaces nécessaires. Une mutagenèse systématique de tous les acides aminés exposés à permis l'identification de plusieurs surfaces d'interaction de TBP. Les propriétés de ces mutants ont été évaluées dans des expériences in vitro avec des promoteurs pol II et pol III, ou par transfection transitoire avec des promoteurs et activateurs artificiels. Cette approche a permis de mieux comprendre les rapports structure-fonction de TBP, mais elle est limitée par le fait que les essais in vitro ne reproduisent pas la complexité de la situation réelle in vivo avec la diversité des promoteurs cellulaires. Nous avons mis en place un système unique pour l'étude de TBP in vivo utilisant des fibroblastes embryonnaires dans lesquels, un des allèles codant pour TBP a été inactivé, et l'autre 'floxé' de sorte que le TBP endogène puisse être inactivé par la recombinase Cre. La perte de TBP endogène provoque la mort cellulaire, mais la viabilité peut être préservée par l'expression de TBP sauvage (étiqueté Flag-HA, F-H-) à partir d'un rétrovirus. Nous avons examiné la capacité de plusieurs F-H-TBP mutants à complémenter l'inactivation de TBP endogène. Des lignés clonales exprimant uniquement les F-H-TBP mutants ont été établies. La plupart des mutants testés sont capables d'assurer la viabilité cellulaire, mais un phénotype de croissance lente est souvent observé. Nous avons étudié une ligné mutante plus en détail mettant en évidence le fait que seule l'expression d'un nombre limité de gènes est affectée. Nous demandons des fonds pour poursuivre cette étude par la génération de lignés exprimant de nouveaux F-H-TBP mutants. Nous nous servirons de ces lignés pour évaluer, 1) la capacité des TBP mutants à assurer la viabilité cellulaire et une prolifération normale, 2) leur effets sur l'expression génique par analyse microarray, 3) le recrutement de F-H-TBP aux promoteurs cibles par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et ChIP-on-chip, 4) le recrutement des GTFs et d'autres facteurs interagissant avec F-H-TBP sur les promoteurs cibles par ChIP et ChIP-on-chip, 5) coupler la purification en tandem du F-H-TBP à la spectrométrie de masse afin de déterminer si les mutations affectent les interactions de TBP avec ses partenaires et d'identifier de nouveaux interactants, 6) remplacer le TBP endogène par des fusions GFP-TBP sauvage et mutants afin d'évaluer la mobilité intracellulaire de TBP en temps réel dans les cellules vivantes et dans les cellules où l'expression d'un des interactants a été réduite par siRNA. Ces expériences constituent une approche originale et ambitieuse pour étudier les rapports structure-fonction de TBP in vivo. L'intégration des informations obtenues des expériences transcriptomiques, de ChIP (-on-chip), de protéomique et d'imagerie permettra une vue complète de l'organisation du processus d'initiation de la transcription par TBP et une compréhension de la façon dont il régule la prolifération cellulaire. Une grande synergie existe entre les équipes. Partenaire 1 est la seule équipe au monde à disposer des cellules nécessaires à cette étude. Partenaire 2 est une des plateformes de référence dans le domaine de la spectrométrie de masse en France, et partenaire 3 a une expérience dans l'imagerie, le ChIP et la spectrométrie de masse. Partenaires 1 et 3 ont une expérience importante dans le domaine de la biochimie et la biologie moléculaire et un intérêt historique pour TBP et ses partenaires dans la régulation de la transcription et ils ont déjà collaboré dans le cadre de réseaux Européens où ce travail a été initié. Partenaires 1 et 2 ont également collaboré sur d'autres projets et celui-ci se place dans le contexte de la mis en place d'une nouvelle plateforme de spectrométrie de masse entre l'IGBMC et le laboratoire de Van Dorsselaer pour le développement de nouvelles techniques de spectrométrie de masse.