– TranscripDyn

1-Contexte scientifique et objectifs du projet : La transcription, le processus de biosynthèse de l'ARN, est la première étape importante de l'expression génique. Elle est contrôlée par un ensemble d'événements dynamiques mal compris qui impliquent les composants du complexe ternaire de transcription et des co-facteurs protéiques ou métaboliques. Pour élucider les séquences d'événements moléculaires transitoires impliquées dans la régulation de la transcription, nous proposons une nouvelle stratégie expérimentale intégrant des méthodes biophysiques et biochimiques de premier plan. Cette stratégie implique trois démarches principales : 1) Utiliser et développer des techniques d'immobilisation sur support solide pour préparer et manipuler à souhait des populations homogènes de complexes transcriptionnels; 2) Adapter des approches chimio-génétiques combinatoires pour identifier, à l 'échelle atomique, les contacts ARN-protéine importants pour la régulation de la transcription; 3) Identifier par microscopie de fluorescence de molécules uniques (MFMU) les mouvements et les comportements catégoriels (ou individuels) impliqués, aux niveaux moléculaire et infra-moléculaire, dans les voies de régulation transcriptionnelle et, ainsi, situer dans le temps des évènements régulateurs spécifiques (comme la formation de contacts transitoires ARN-protéine). Nous démontrerons le potentiel remarquable de cette stratégie innovante en élucidant les mécanismes moléculaires de la terminaison de la transcription Rho-dépendante. La protéine Rho appartient à la famille des hélicases structurées en anneaux hexamériques et utilise l'énergie résultant de son activité ATPasique pour se déplacer le long de chaînes ARN et dissocier des obstacles moléculaires tels que le complexe d'élongation de la transcription (CET), sa cible biologique. De nombreux détails moléculaires de la terminaison Rho-dépendante sont encore inconnus; c'est néanmoins un modèle très intéressant de régulation dynamique de la transcription car il implique la compétition et l'interaction entre deux nanomachines en mouvement (Rho et le CET). 2-Description du projet, méthodologie : Pour révéler les aspects moléculaires et cinétiques essentiels de la terminaison Rho-dépendante dans son contexte dynamique, nous utiliserons les techniques d'assemblage du CET sur squelette d'acides nucléiques et de transcription en phase solide pour préparer des cibles CET sensibles à l'action de Rho. L'immobilisation sur support solide et l'avancement pas-à-pas de la polymérase sur sa matrice ADN permettront la synchronisation initiale des CET et l'étude contrôlée de la terminaison Rho-dépendante depuis différentes positions de départ le long du chemin réactionnel. En parallèle, nous préparerons des substrats ARN-ADN pour étudier Rho de façon indépendante, via son activité hélicase. Les substrats 'hélicase' et CTE immobilisés seront utilisés dans des expériences de cartographie combinatoire des groupements de l'ARN et des interactions ribonucléoprotéiques importants par interférence chimique avec des sondes nucléotidiques (méthodes NAIM et NAIS). Couplées à l'initiation de la réaction par ajout de NTPs, ces expériences révéleront les contacts tertiaires transitoires impliqués dans la compétition cinétique et l'interaction déstabilisante entre les nanomoteurs Rho et CET. Par ailleurs, nous introduirons des fluorophores à des positions spécifiques de Rho, de la polymérase et des chaînes ARN et ADN dans le but de mesurer les distances entre ces différents composants par Transfert d'énergie de Fluorescence (FRET) à l'échelle de la molécule unique. Des assemblages Rho- CET et Rho-ARN contenant plusieurs sondes fluorescentes seront préparés, immobilisés sur support solide et utilisés dans des expériences de MFMU multi-couleurs novatrices pour déterminer la topologie des complexes moléculaires et suivre leur évolution au cours du temps. Enfin, des expériences de MFMU réalisées avec des mutants ponctuels ARN et proté