Etudes structurales et fonctionnelles des récepteurs couplés aux protéines G et des canaux ioniques à l'aide de toxines peptidiques. – gpcrcanotox

1-Contexte scientifique et objectifs du projet : La résolution de la structure à haute résolution des protéines membranaires reste l'un des grands défis de la biologie structurale. Actuellement, les coordonnées atomiques de protéines membranaires représentent 0,6 % des coordonnées de la Protein Data Bank qui contient plus de 35000 structures de macromolécules biologiques, alors que les gènes codant pour de telles protéines constituent environ 30% des génomes. L'élucidation de nouvelles structures de protéines membranaires aura non seulement un grand impact sur les connaissances fondamentales de processus essentiels tels que la transduction du signal, la réponse immunitaire, l'excitabilité cellulaire, le transport membranaire et les pathologies associées, mais sera aussi d'une importance majeure pour l'industrie pharmaceutique qui utilise de plus en plus la conception de médicaments basée sur les structures (structure-based drug design) comme outil de développement. Le présent projet a pour intention d'utiliser différentes toxines de venins identifiées comme ligands spécifiques pour aider à la production, à la purification et à la cristallisation des protéines membranaires eucaryotes correspondantes. L'objectif recherché est d'exploiter au mieux les interactions toxines/protéines afin d'obtenir des complexes stables aux propriétés particulièrement propices à la réalisation d'études structurales. 2-Description du projet, méthodologie : Ce projet associe un laboratoire impliqué dans les domaines de l'expression, de la purification et de la cristallisation des protéines membranaires, notamment des Récepteurs Couplés aux Protéines G eucaryotes (RCPG) et récepteurs (transporteurs) membranaires bactériens, et un laboratoire travaillant sur la caractérisation des toxines d'animaux venimeux et sur leur utilisation en génie des protéines. Au travers de sa participation à différents réseaux de génomique structurale membranaire, le premier laboratoire a développé une importante plateforme d'expression lui permettant de disposer d'une vaste collection de protéines membranaires recombinantes, et a validé des procédures de production et de purification permettant d'en amener certaines d'entre elles à l'étape de cristallisation. Le deuxième partenaire a une très grande expertise des toxines notamment peptidiques pour lesquelles il dispose de données complètes sur la structure et la fonction, et d'un savoir-faire unique pour leur production par synthèse chimique ou à l'aide de systèmes d'expression bactériens. Dans le cadre de ce projet, l'interaction des deux laboratoires devrait permettre de tester la stabilité d'une petite sélection de protéines membranaires (5 à 10) produites à l'aide de différents systèmes d'expression et mises en présence de toxines spécifiques tout au long des procédures de production et de purification. Les toxines pourraient ainsi stabiliser une conformation de la protéine favorable à sa cristallisation ou permettre l'établissement de contacts intermoléculaires entre les complexes favorables à leur cristallisation. En parallèle, la fonctionnalisation de certaines toxines (biotinylation, fusion à des fluorophores...) devrait permettre d'évaluer l'utilité de telles molécules pour l'amélioration des procédures de détection et/ou de purification des protéines membranaires. Enfin, la mise en commun des savoir-faire et des plateformes d'expression devrait permettre d'explorer de nouvelles techniques de bioproduction pour les toxines, mais devrait aussi servir comme moyen de criblage idéal pour la caractérisation de nouvelles toxines. 3-Résultats attendus : Les principaux résultats sont l'obtention et la caractérisation de plusieurs complexes toxines/protéines membranaires stables. En fonction de la stabilité de ces complexes, nous pensons obtenir des cristaux pour un certain nombre d'entre eux avec à la clef la résolution de la structure 3D des complexes. En marge de ces attentes majeures, nous sommes confiants dans l'obten