– virnanomotor

Ce projet a pour objectif d'étudier le mécanisme moléculaire de l'encapsidation de l'ADN d'un phage au cours de son assemblage et de son éjection lors de l'infection. Contexte scientifique L'encapsidation de l'ADN double-brin de phages est initiée par la formation d'une procapside dont la maturation s'accompagne du transport de l'ADN. Ce transport s'effectue par l'intermédiaire d'un puissant moteur moléculaire constitué de la protéine portale, localisée à un des vertex de la capside et formant le pore d'entrée de l'ADN, d'un complexe multiprotéique la terminase- qui reconnaît l'ADN et l'arrime à la portale. L'activité ATPasique de la terminase fournit l'énergie nécessaire à la translocation de l'ADN. Bien que nos connaissances soient en progrès constant, on ne connaît pas le mécanisme par lequel l'ADN est transporté dans la capside. 2 modèles ont été proposés. Le 1er suppose un couplage entre rotation de la portale et translation de l'ADN, l'énergie étant fournie par la terminase. Dans le second modèle le mouvement de l'ADN est directement généré par la terminase. Le transfert de l'ADN de phage dans la bactérie hôte est un processus en plusieurs étapes. La fixation spécifique de protéines de la queue du phage sur un récepteur de la surface bactérienne induit des changements conformationnels qui sont transmis à la capside induisant son ouverture et l'éjection de l'ADN qui est alors transféré linéairement à travers l'enveloppe de l'hôte jusqu'au cytoplasme. Il a été proposé que la pression très forte (60 Atm) existant dans la capside du fait de la condensation de l'ADN lors de l'encapsidation soit responsable de son éjection. Ce modèle ne prend toutefois pas en compte l'extrême diversité et complexité des mécanismes encore mal connus- de transport de génomesde virus bactériens. Objectifs et méthodologies: nous nous proposons de combiner des approches biochimiques et de physique sur molécule isolée (imagerie de fluorescence, pinces magnétiques, électrophysiologie) afin d'analyser le mécanisme de couplage entre (i) le fonctionnement du moteur d'encapsidation et la dynamique d'encapsidation de l'ADN ; (ii) dynamique de l'encapsidation et de l'ejection de l'ADN. Dans la mesure du possible nous compléterons ces informations dynamiques par des études structurales par diffusion et diffraction des rayons X sur les protéines et complexes protéiques impliquées dans ces mécanismes. Le coliphage T5 servira de modèle. Le transport atypique de son ADN (121 kpb) fait l'objet d'études in vitro et in vivo dans l'équipe coordinatrice. Celle-ci, après avoir séquencé le génome de T5, a aussi entrepris l'étude du mécanisme d'encapsidation. Nous tenterons de répondre aux questions suivantes : Par quel mécanisme le moteur d'encapsidation convertit-il l'énergie d'hydrolyse de l'ATP en travail mécanique ? Quelles sont les protéines du moteur se déplacant sur l'ADN ? Quelles sont les forces agissant sur l'ADN qui permettent son organisation spatiale dans la capside et son éjection séquentielle ? La présence de cassures simple brin sur l'ADN (nicks) impose-t-elle des contraintes à l'encapsidation ? De quelle manière les protéines structurales de la queue du phage propagent-elles le signal d'éjection de l'ADN jusqu'à la capside ? Quels sont les rôles joués par la pression osmotique, les protéines de liaison de l'ADN, les nicks, les facteurs de transcription et la RNA polymérase dans l'éjection de l'ADN et son transfert chez l'hôte. Peut-on déterminer en temps réel la dynamique de l'éjection et les forces mises en jeu ? Résultats attendus : # la détermination (i) de la structure de la capside et de ses composants; (ii) des changements conformationnels accompagnant l'encapsidation de l'ADN # la caractérisation des protéines constituant le moteur d'encapsidation et l'activité translocase d'ADN de la terminase par microscopie de fluorescence sur molécule unique # la mise au point d'un modèle d'encapsidation in vitro de l'ADN afin de suivre, ...