Etudes structurales des machineries moléculaires initiant la formation de filaments d'actine – actin-nuclei

La motilité cellulaire est essentielle aussi bien dans l'embryogénèse, la réparation des tissus, la réponse immunitaire que dans des processus pathologiques tels que le cancer. Le cytosquelette d'actine est le moteur cellulaire qui guide la motilité cellulaire en aval d'une cascade complexe de transduction des signaux. Le projet explore les mécanismes structuraux de trois machineries responsables de l'initiation de nouveaux filaments d'actine qui reposent sur le complexe Arp2/3 avec le domaine C-terminal VCA de WASP, et les protéines formines et spires. Ces machineries opèrent dans divers processus cellulaires et utilisent différents mécanismes encore sujets à controverse au niveau biochimique et biophysique et qui ne sont pas encore compris au niveau structural. Nous ciblons la structure des complexes fonctionnels de ces protéines avec l'actine. Le domaine C-terminal VCA de WASP catalyse le branchement de filaments en utilisant le complexe Arp2/3 de 220 kDa. Cette machinerie génère un réseau dendritique et branché de filaments d'actine responsable du déplacement de l'avant des cellules motiles eucaryotes. Résoudre la structure d'un complexe Arp2/3-VCA-actin de 280kDa est essentiel pour comprendre le mécanisme de branchement des filaments. Les formines interviennent dans la formation de faisceaux de filaments non branchés au niveau des fibres de stress ou de l'anneau de cytokinèse. Les formines, en association avec la protéine profiline, agissent comme des moteurs processifs de l'assemblage d'actine à l'extrémité barbée des filaments. La structure d'un complexe formine-profiline-actine de 270 kDa permettrait d'expliquer le mécanisme de processivité. Les protéines Spire nucléent les filaments d'actine lors de la morphogénèse embryonnaire via l'interaction de quatre domaines WH2 avec l'actine. La structure de ces domaines en complexe avec l'actine éclairera sur leur mécanisme de nucléation mal caractérisé. Le travail de biologie moléculaire, expression, purification de ces différents éléments a commencé et se développe en étroite collaboration avec des études biochimiques et biophysiques conduites dans l'équipe de M.F. Carlier. La combinaison de ces approches sur des sujets d'importance fondamentale et médicale permettra d'élucider de manière très détaillée les mécanismes moléculaires étudiés dans un environnement très compétitif. Quelques résultats préliminaires ont pu être obtenus avec un fragment C-terminal de N-WASP (VCA) que nous avons obtenu avec une tres bonne pureté et quantité et pour lequel des essais de cristallisation ont été lancé pour piéger un complexe fonctionnel Arp2/3-VCA-Actin. Les premières constructions de formine et Spire ont conduit majoritairement à des constructions peu stables mais ont permis de cerner les régions importantes pour le repliement et l'activité. De nouvelles constructions de Spire sont maintenant en cours de purification.