– MDR ATPases

L'objectif est d'établir le mécanisme moléculaire, fonctionnel et structural, des transporteurs ABC ( ATP-binding cassette ) polyspécifiques, responsables du phénotype cellulaire MDR ( multidrug resistance ). La découverte d'inhibiteurs spécifiques et puissants contre ces protéines membranaires complexes est d'un intérêt biomédical considérable. La résistance de la croissance cellulaire à de nombreux agents cytotoxiques est souvent due à l'augmentation de leur efflux par surexpression de transporteurs ABC dans la membrane plasmique. On observe une résistance ubiquitaire contre les chimiothérapies, des bactéries pathogènes contre les antibiotiques aux tumeurs contre les anticancéreux. Ces transporteurs polyspécifiques constituent une classe unique de protéines membranaires, comme Pompes ATPases de Multiples drogues (MAPs). Des questions essentielles restent à résoudre: Pourquoi peu des drogues fixées sont-elles transportées ? Où se fixent les modulateurs spécifiques ? Comment inhibent-ils ou stimulent-ils l'activité de transport ? Quel type de communication est impliqué entre hydrolyse d'ATP et transport de drogues ? Quels changements conformationnels sont-ils impliqués ? Le projet regroupe 3 équipes Françaises complémentaires, de Lyon, Grenoble et Paris, autour de 6 MAPs de différentes topologies, représentatives des 3 classes impliquées, pour étudier la polyspécificité de fixation et transport de drogues, les changements de conformation associés et leur analyse structurale. L'équipe 1 étudiera 3 MAPs eucaryotes : le mécanisme de transport du GSH sera abordé sur Yor1p de levure et MRP1 humain (classe C) ; les activateurs tels que vérapamil et flavonoïdes, induisant la mort cellulaire par apoptose, établiront les relations structure-activité pour construire un pharmacophore par modélisation moléculaire. Des partenaires protéiques de MRP1 seront recherchés in vivo par pontages cellulaires ou in vitro par pêche aux ligands . De nouvelles stratégies de peptides inhibiteurs contre BCRP (classe G) concerneront des peptides synthétiques conçus à partir d'un modèle moléculaire issu de la structure de MsbA, et une vaste chimiothèque de D-octapeptides ciblant les boucles extracellulaires. Les séquences stratégiques et résidus critiques pour le transport seront étudiés par mutagenèse. La reconstitution en liposomes des protéines purifiées permettra l'étude du mécanisme moléculaire de transport des drogues, et des modifications en présence d'inhibiteurs spécifiques. L'équipe 2 étudiera les changements de conformation de 3 MAPs bactériennes. BmrA (classe B) est fortement surexprimé ; sa purification et reconstitution autorisent sa caractérisation biochimique et biophysique, la mutagenèse dirigée permettant d'insérer des sondes spécifiques ou de faciliter la cristallisation. La réintroduction dirigée de cystéine donnera accès aux conformations ouverte ou fermée du cycle catalytique, et le couplage entre sites de fixation de l'ATP et des drogues sera visualisé par variations de fluorescence des tryptophanes et mutagenèse dirigée. L'asymétrie fonctionnelle de l'hétérodimère YheI/YheH (classe C) et l'implication possible de Rv1747 (classe G) de Mycobacterium tuberculosis dans l'efflux de défensines humaines seront étudiées. En plus de la reconstitution en liposomes pour les études fonctionnelles des MAPs, l'équipe 3 réalisera leur analyse structurale par des méthodes récentes utilisant peu de protéine membranaire purifiée. Les protéines en détergent seront analysées en particules uniques par cryo-microscopie électronique, alors que la reconstitution en liposomes permettra la cristallisation 2D en solution ou en interaction avec une monocouche fonctionnalisée (faisabilité démontrée avec BmrA), ou en surface de goutte pendante. L'analyse structurale sera optimisée en combinant microscopie électronique et microscopie à force atomique. Les résultats attendus concernent des avancées significatives dans la connaissance...