Analyse génomique des voies de synthèse des toxines paralysantes des dinoflagellés à partir de librairies transcriptomiques – GenoSynTox

Dans ce projet, nous proposons d'identifier des gènes codant des enzymes impliquées ou associées à la synthèse de toxines paralysantes dans des dinoflagellés du genre Alexandrium. Ces algues phytoplanctoniques forment des développements importants (ou floraisons) dans les eaux côtières. Les toxines qu'elles contiennent sont accumulées dans les mollusques filtreurs (moules, huîtres), lesquels au delà d'un certain seuil deviennent impropres à la consommation humaine. Faute de réseaux de veille sanitaire prévenant la consommation des mollusques contaminés, les floraisons toxiques ont pendant longtemps été la cause de graves intoxications connues sous le nom d'intoxications paralysantes par les coquillages. Les réseaux de surveillance sanitaire ont permis d'écarter le risque d'intoxication en restreignant la récolte des coquillages dans les zones contaminées. Cependant, les méthodes d'analyse mises en œuvre sont longues et fastidieuses (observations microscopiques et analyses chimiques des toxines). En outre, ces méthodes ne permettent de détecter les floraisons que quand les cellules toxiques sont déjà assez nombreuses pour pouvoir être observées, soit peu de temps avant que la toxicité n'apparaisse dans les coquillages. La mise au point d'outils de détection des algues toxiques, qui permettraient une détection plus sensible, plus précoce et plus facile des floraisons toxiques en formation, est donc un enjeu crucial pour les réseaux de surveillance. Les toxines paralysantes, ou saxitoxines, comptent une vingtaine de composés ayant des potentiels toxiques différents. La capacité de synthèse des toxines est déterminée génétiquement et chaque souche algale produit un assemblage spécifique de toxines. Les enzymes impliquées dans la formation du squelette toxinique puis dans ses transformations ne sont pas ou peu connues. Aucune donnée génétique relative à ce processus de synthèse n'est disponible à ce jour. Les saxitoxines sont des molécules riches en azote et formées à partir de quatre résidus d'acides aminés. Des travaux expérimentaux en culture ont démontré que la synthèse de ces toxines est dépendante de la disponibilité de nutriments azotés pour les cellules : un excès d'azote dans le milieu favorise la synthèse et l'accumulation des toxines dans les cellules, alors qu'une forte déficience en azote réprime cette synthèse. Ce travail recherchant des gènes associés à la synthèse des saxitoxines sera conduit en analysant des librairies d'expressions obtenues à partir de plusieurs souches d'Alexandrium, 3 souches sélectionnées avec des profils toxiniques différents et une souche non toxique. Pour mettre en évidence les gènes d'intérêt, les souches sélectionnées seront cultivées selon deux conditions différentes, d'une part en condition d'excès d'azote pour obtenir des cellules exprimant ces gènes, et d'autre part en condition déficiente en azote pour obtenir des cellules ne les exprimant pas. Ces cultures seront réalisées en régime semi-continu pour maintenir la croissance des cellules dans le milieu déficient en azote, tout en permettant l'échantillonnage des cellules pour l'extraction des ARN. A partir des différentes populations de cellules obtenues, des librairies d'ADNc seront produites selon une procédure de normalisation afin d'accroître la proportion des transcrits (ARNm) rares de ces librairies : on suppose en effet que les gènes de synthèse toxinique ne sont pas aussi abondamment exprimés que les gènes du métabolisme général des cellules. Ensuite, une procédure de soustraction sera utilisée, entre les librairies de cellules synthétisant les toxines et celles ne les synthétisant pas, pour éliminer les transcrits des secondes présents dans les premières, c'est à dire les transcrits de gènes exprimés indépendamment de l'état nutritionnel des cellules et de l'activité de synthèse toxinique. Les quatre librairies soustractives obtenues seront ensuite clonées et séquencées aléatoirement. Jusqu'à 2000 clones seront séquencés .