– RNA_RECOD

Contexte scientifique et objectifs du projet. Le décodage de l'information génétique peut parfois être modifié par des séquences et structures sur l'ARNm, on parle alors de recodage. L'analyse de ces déviations est un moyen puissant pour comprendre le fonctionnement normal de la machinerie de traduction. Les quatre équipes impliquées dans ce projet développent des approches complémentaires qui ont permis de caractériser plusieurs éléments impliqués dans le recodage. Très récemment, nous avons réussi à décrypter le rôle précis de ces structures dans le décalage de cadre de lecture en -1, par des analyses en cryo-microscopie électronique. Il s'agit d'un projet pluridisciplinaire impliquant des spécialistes de biochimie, biologie moléculaire, génétique, biologie structurale et bioinformatique. Deux des équipes sont Françaises et sollicitent un financement, les deux autres sont Britanniques et, bien que très impliquées dans le projet, ne sollicitent pas de financement. Les objectifs sont de : i) comparer les mécanismes moléculaires et les modifications structurales impliqués dans plusieurs événements de recodage (décalage en -1, en +1, incorporation de pyrrolysine) et ii) identifier de nouveaux sites de recodage dans les génomes. Description du projet, méthodologie. Nos résultats récents montrent que le pseudo-noeud impliqué dans la stimulation du décalage en -1 n'induit pas seulement une pause dans l'élongation, mais modifie également la structure du ribosome au niveau du canal d'entrée de l'ARNm. Cette étude structurale suggère que les protéines ribosomiques S2, S3 et S9 (S3, S4 et S5 d'Escherichia coli), ainsi que le facteur eEF2, pourraient jouer un rôle essentiel dans le décalage. Nous effectuerons une mutagenèse aléatoire saturante des gènes correspondants et rechercherons des mutants capables de stimuler le décalage chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Pour cela, nous tirerons profit d'un crible que nous avons mis au point et qui permet de sélectionner des facteurs modulant le taux de recodage. Une analyse biochimique in vitro, à partir d'extraits des mutants isolés, permettra de déterminer quelle étape du recodage est affectée. Dans une deuxième partie, nous effectuerons une analyse par cryo-microscopie électronique, similaire à celle précédemment utilisée, pour aborder le mécanisme du décalage en +1. Nous utiliserons pour cela le modèle du gène de l'antizyme de l'ornithine décarboxylase de mammifère. Plusieurs données suggèrent que les mécanismes de décalage en -1 et en +1 pourraient être différents, bien que contrôlés par des structures de type « pseudo-noeud » qui semblent similaires (en deux dimensions). Nous pourrons ainsi comparer les conséquences de la présence des deux types de pseudo-nœud sur la structure du ribosome. Leurs propriétés respectives devraient clarifier les mécanismes responsables du décalage en -1 ou en +1. Le dernier thème concerne le mécanisme nouvellement identifié d'incorporation de pyrrolysine (le « 22ème acide aminé ») dans certaines protéines de bactéries méthanogènes. Il s'agit d'un mécanisme de recodage, beaucoup moins bien caractérisé que les décalages évoqués plus haut, mais dans lequel nous avons proposé qu'une structure secondaire (appelée « PYLIS ») joue également un rôle clé. Deux types d'approches seront développées : Une approche moléculaire dans laquelle la structure prédite sera recherchée par mutagénèse dirigée, et une approche bioinformatique visant à identifier d'autres structures secondaires dans des gènes connus codant des protéines à pyrrolysine. Cette dernière devrait également nous permettre d'identifier de nouveaux gènes de ce type. Dans un deuxième temps, une analyse par cryo-electromicroscopie sera également sur ce modèle de recodage. Nous avons mis en place les différents outils moléculaires et biochimiques pour mener cette étude, le seul verrou méthodologique qui persiste concerne la synthèse chimique de pyrrolysine qui est délicate. Nous sommes en contact avec l