Photolyse ciblée de protéines par incorporation d'un alpha-amino-acide non naturel: Régulation in vivo de l'activité de récepte membranaires – Photoprotéolyse

Photolyse ciblée de protéines par incorporation d'un ±-amino-acide non naturel: Régulation in vivo de l'activité de récepteurs membranaires Le présent projet de recherche prévoit l'incorporation d'un ±-amino acide non naturel dans des séquences de protéines fonctionnelles pour une photorégulation de leur activité par protéolyse ciblée de la chaîne polypeptidique au niveau du site d'incorporation. Ces «photo-protéases» seront utilisées pour analyser in vivo, dans l'ovocyte de Xénope, le processus d'inactivation d'un canal calcique ainsi que l'activation de récepteurs de la thrombine. Quatre équipes de recherche participent à ce projet garantissant ainsi l'expertise nécessaire à toutes ses étapes. Le laboratoire de Chimie Bioorganique a conçu un nouvel ±-amino acide : 1-(4,5-dimethoxy-2-nitrophenyl)ethyle-1±-glycine (DMNPEG), qui, une fois incorporé dans un peptide, permet un clivage photochimique efficace de ce dernier. L'incorporation d'un tel amino acide dans une protéine permettra une photorégulation contrôlée de son activité. Cette incorporation se fera par suppression de codons stop, couplée à l'expression hétérologue dans des ovocytes de Xénopes pour les études in vivo. (Partenaire 2) Le porteur du projet effectuera les synthèses des DMNPEG et du dérivé thioéthyle correspondant (DMNPTEG) sous formes optiquement actives. Toutes les analyses photochimiques (efficacité, rendement quantique, cinétiques de photo-fragmentation) seront également effectuées dans ce laboratoire. Une expérience modèle préliminaire a permis de démontrer la faisabilité de la réaction de photolyse. La synthèse d'un ARNt suppresseur chargé avec l'acide aminé DMNPEG sera effectuée dans le laboratoire de l'IBMC (Partenaire 3). Cette synthèse nécessitera en particulier d'utiliser un ARNt tronqué qui sera couplé à un dinulcléotide pCA-aa utilisant une T4 ARN ligase. Un chercheur post-doctoral est demandé dans ce projet pour une durée de 2 années entre les deux laboratoires. Applications biologiques : Du canal calcique dépendant du voltage, dépend l'adaptation du fonctionnement de la cellule à son activité électrique. Ce couplage électro-chimique est réalisé par l'ouverture, pilotée par le potentiel de membrane, d'un pore sélectif pour le Ca2+ qui subit également un mécanisme d'inactivation empêchant toute surcharge calcique délétère pour la cellule. Cette inactivation, qui est reliée à différentes situations physiologiques ou physiopathologiques, est le résultat d'interactions intramoléculaires très fugaces, sous la dépendance du Ca2+ et du voltage, aboutissant à l'obturation du pore. L'analyse moléculaire de ces réarrangements intra-protéiques se heurte à une barrière méthodologique. Seule l'électrophysiologie apporte une résolution temporelle suffisante avec un contrôle du potentiel permettant de geler différents états fonctionnels du canal, mais elle n'apporte malheureusement aucune donnée structurale. L'incorporation d'acides aminés photosensibles développés par le partenaire 1 en des sites précis sur le canal ou ses sous-unités régulatrices, et l'enregistrement de courants calciques, avant, pendant et après photolyse ciblée par un flash UV permettra d'analyser, in vivo, en temps réel et avec un contrôle interne, le rôle de séquences et d'interactions intramoléculaires particulières du canal dans l'inactivation. L'ensemble de ces expériences seront effectuées par l'équipe de Montpellier qui demande le financement d'un IR durant 30 mois (Partenaire 2). L'activation, par voie photochimique, de récepteurs couplés aux protéines G de la thrombine est envisagée et sera entreprise dans une seconde phase, en collaboration avec l'équipe INSERM U311 (Partenaire 4). Cette activation est tributaire de la libération d'un peptide N-terminal non modifié et nécessitera la synthèse d'un acide aminé analogue (DMNPTEG) qui permettra cette protéolyse. En cas de succès, la même stratégie globale sera utilisée et l'activation photochimique de ces récepteurs sera...