– Gram(+) NADK

Dans le contexte du séquençage rapide des génomes et de la recherche de nouveaux médicaments, la caractérisation de nouvelles cibles doit être rationalisée et accélérée. Notre projet consiste en la mise en place d'outils adaptés pour la détermination rapide (quelques années) de structures des ligands optimaux pour une protéine donnée. Cette méthodologie suppose que la cristallographie des complexes soit menée en interaction étroite avec la chimie combinatoire focalisée. Elle sera appliquée au cours de ce projet à un cas exemplaire, celui des NAD kinases, dont le gène n'a été identifié que récemment au sein des différents génomes connus. L'approche ainsi mise en place sera aisément généralisable à de nombreuses familles de protéines, notamment celles interagissant avec des nucléobases, fragments présents dans les ligands conçus dans le cadre de ce projet. Les NAD kinases (NADKs) appartiennent à un groupe original de kinases au sein duquel se trouvent aussi les 6-phosphofructokinases et les diacylglycérol/sphingosines kinases. Ces deux dernières interviennent dans des voies de signalisation (par phosphorylation d'un lipide second messager) et, de ce fait, sont impliquées dans différents cancers. Les NADKs catalysent la synthèse de NADP co-facteur ubiquitaire et essentiel pour de nombreuses enzymes. Les kinases de cette super-famille constituent donc de nouvelles cibles thérapeutiques intéressantes. Les structures de différentes NADKs (Mycobacterium tuberculosis, Archeoglobus fulgidus), en présence de leur substrat (NAD) et du produit de la réaction (NADP), viennent d'être résolues. Les structures de la NAD kinase de L. monocytogenes (LmNADK1) que nous venons de déterminer ont permis : 1) de mieux caractériser le site actif du substrat NAD qui est composé de deux cavités distinctes (A et N), où se fixent respectivement l'adénosine et le nicotinamide; 2) d'apporter des précisions sur le mécanisme enzymatique et notamment sur la formation d'un nouveau composé biologique, le 2' P-ATP; 3) de caractériser le premier complexe d'une NAD kinase avec un inhibiteur, le 5'-thioadénosine capable de dimérisation (par pont disulfure) et de mettre ainsi en évidence un nouveau pharmacophore du site N. Le di-(5'-thioadénosine) s'est révélé être inhibiteur de la LmNADK1 avec une constante d'inbibition (IC50) de 100 microM (résultats non publiés). Ce projet pluridisciplinaire a pour but de développer des molécules inhibitrices spécifiques de la NAD kinase enzyme en s'appuyant d'une part sur du criblage virtuel focalisé et sur la détermination de nouvelles structures cristallographiques de complexes protéine-ligands, et d'autre part sur la sélection et/ou la synthèse de nouveaux pharmacophores (fragments moléculaires occupant soit le site A soit le site N) qui seront testés par enzymologie et/ou cristallographie. Les pharmacophores les plus efficaces seront ensuite assemblés pour former des inhibiteurs plus affins. Plusieurs types de pontage seront envisagés au cours de ce projet. Dans un premier temps, nous chercherons à produire des dérivés des pharmacophores possèdant des fonctions réactives adaptées à la combinaison in situ (ex. : pour la formation de ponts disulfure ou d'acylhydrazones), la déconvolution sera alors faite par cristallographie. Nous chercherons ensuite à optimiser (gain enthalpique), à rigidifier (gain entropique) et à stabiliser (tests sur bactéries entières) le pontage entre les différents pharmacophores criblés. Cette seconde partie se fera en deux étapes : d'abord par chimie combinatoire focalisée par métathèse et déconvolution par cristallographie, puis pour une optimisation finale par synthèse dédiée. Nos travaux préliminaires ont porté sur l'enzyme de L. monocytogenes et nous étendrons notre approche structurale à d'autres NADKs de bactéries pathogènes Gram positives, et plus particulièrement à celle d'un pathogène régulièrement multi-résistant aux traitements actuels : Staphylococcus aureus. L'étude de la spécifici