Compréhension du TRANSport ADP/ATP dans les membranes MITochondriales, entre expérience et théorie – TRANS-MIT

Contexte scientifique Les protéines membranaires sont essentielles pour la communication cellulaire et les processus d'échanges entre compartiments cellulaires ou cellules. Elles jouent donc un rôle clef dans de nombreux processus biologiques. Le transporteur ADP/ATP (AAC) appartient à la famille des transporteurs mitochondriaux (MCF), importants dans plusieurs voies métaboliques. AAC est une protéine membranaire intégrale qui importe l'ADP dans la mitochondrie et exporte l'ATP après synthèse vers le cytosol afin de satisfaire les besoins énergétiques de la cellule. Grâce à son abondance naturelle, AAC a été largement étudié et la structure de la protéine de cœur de bœuf a été résolue à 2.2 Å de résolution en présence d'un inhibiteur, le carboxyatractyloside (CATR) (Pebay-Peyroula et al., 2003). Pour étayer certaines hypothèses émises à partir de cette structure et pour comprendre l'ensemble du mécanisme depuis la sélectivité moléculaire jusqu'aux changements de conformation permettant le transport, des études supplémentaires sont nécessaires. Objectifs: Détail atomique du transport ADP/ATP La combinaison synergique d'expériences (structures d'une ou plusieurs conformations de la protéine) et de modélisation moléculaire devrait permettre de jouer un rôle majeur dans la compréhension du mécanisme fonctionnel de protéines membranaires intégrales. Les simulations numériques sur la structure tridimensionnelle, permettront de déchiffrer à l'échelle atomique les mécanismes impliqués et donneront de nouvelles informations sur la fonction. Les simulations incluant d'autres conformations déterminées expérimentalement permettront de décrire à un niveau précis le mécanisme de transport à travers la membrane. La compréhension du processus de transport et de sa spécificité nécessite non seulement la connaissance des différentes conformations accessibles par le transporteur AAC, mais aussi une comparaison entre différents transporteurs. Une telle description moléculaire jettera les bases pour une compréhension globale du transport des métabolites dans la mitochondrie, en discriminant les événements spécifiques à AAC et ceux communs aux membres de la famille MCF. Le projet abordera également le problème ouvert de l'état d'oligomérisation de AAC. Outre les connaissances fondamentales, les résultats permettront de comprendre les mutations ponctuelles de AAC, et peut-être aussi d'autres transporteurs MCF, responsables de maladies graves (obésité, diabète de type II, épilepsie myoclinique néonatale,..). Description et méthodologies Grenoble. Différentes stratégies de co-cristallisation sont envisagées, soit en présence de petits ligands (inhibiteurs ou nucléotides modifiés), soit avec une protéine soluble connue pour interagir avec le transporteur (cyclophiline-D de la matrice, ou Vpr protéine virale de HIV). Différentes étapes seront abordées: (1) Modification du protocole de purification par design d'une matrice d'affinité pour AAC basée sur les connaissances structurales actuelles, (2) Caractérisation de la protéine purifiée (quantité de lipides et de détergent, stabilité, état oligomérique), (3) Co-cristallisation de AAC dans une autre conformation (approche classique par diffusion de vapeur, ou phase cubique de lipides), (4) Résolution de la structure par diffraction de RX (micro-cristaux sur des lignes de rayonnement synchrotron micro-focalisées). Nancy. À partir de la structure, des calculs de dynamique moléculaire (MD) haute performance permettront d'estimer la différence d'énergie libre impliquée dans le transport assisté de l'ADP dans une direction et de l'ATP en sens opposé. La protéine sera ancrée dans une bicouche de phospholipides totalement hydratée. Les simulations de MD donneront le détail atomique du mécanisme de transport, ainsi que les quantités thermodynamiques associées. Une simulation préliminaire du transporteur dans un environnement de lipide à l'échelle de quelques dizaines de nanosecondes, montre que la structure 3D