– NOperox

Contexte et objectifs. Les dérivés activés de l'oxygène ne sont pas simplement des produits toxiques du métabolisme cellulaire, mais aussi des molécules régulatrices et de signalisation intervenant dans les processus essentiels de vie et de mort cellulaire: prolifération, cycle, apoptose. Le peroxyde d'hydrogène (H2O2) produit en réponse à des facteurs de croissance, de cytokines comme le TNF, ou de mitogènes, est un effecteur efficace de cette signalisation « redox » dont les bases moléculaires commencent juste à apparaître. Des résidus cystéine spécifiques (pKa acide) localisés aux sites allostériques ou catalytiques de protéines sont les principaux détecteurs de H2O2. Ainsi, la formation d'un pont disulfure ou d'un acide sulfénique est une modification réversible qui entraîne une perte ou un gain de fonction. Les peroxirédoxines (Prxs) sont des thiol peroxydases ayant un rôle majeur dans la détoxication des peroxydes et dans le contrôle de la signalisation H2O2. Ces fonctions distinctes font toutes deux intervenir la réduction des peroxydes et l'oxydation d'une cystéine catalytique en sulfénate (RS-OH). Deux découvertes récentes ont été déterminantes pour poser les bases de cette régulation : 1) l'inactivation de 4 des 6 Prxs des mammifères par suroxydation de la cystéine peroxydatique dans la forme sulfinate (RSO2H), et 2) la réversion de cette inactivation par l'identification de deux familles d'enzymes spécifiques des Prxs capables de réduire leur forme sulfinate: la sulfirédoxine (Srx) et les sestrines, ces dernières étant d'ailleurs régulées par la p53. Le monoxyde d'azote (NO) est aussi une autre importante molécule de signalisation impliquée dans de nombreux processus vitaux (différentiation, apoptose, cycle cellulaire, réponse de l'hôte face aux pathogènes, ...). NO intervient notamment comme régulateur de l'expression des gènes via des régulateurs comme HIF-1? ou p53. Notre objectif est de montrer qu'une production physiologique de NO par des cellules murines primaires prévient la suroxydation des Prxs via la Srx ou les sestrines et au-delà, induit l'inactivation de PTEN par oxydation, et l'activation excessive de la voie Akt. Description du projet et méthodes. Le projet consiste à mesurer en parallèle : - L'expression des Prxs par PCR en temps réel et par Western blot Leur suroxydation par Western blot et spectrométrie de masse après électrophorèse en 2 dimensions - L'expression et l'activité de Srx et des 3 sestrines, (Western blot et dosage enzymatique) et leur rôle individuel, en inactivant l'expression de leur gène par interférence ARN et invalidation chez la souris. L'état redox de PTEN et l'expression de la forme active (phosphorylée) d'Akt par Western blot. Nous examinerons ces paramètres dans des macrophages murins différenciés à partir de précurseurs de la moelle osseuse provenant de souris, soit sauvages, soit déficientes pour le gène de NO synthase 2. Les macrophages seront alors stimulés pour la production d'H2O2 et/ou pour la production de NO via la NOS2. Résultats attendus. Notre projet cherche à identifier un croisement entre signalisation par l'H2O2 et par le NO. La caractérisation de l'état redox des Prxs dans des macrophages stimulés pour la production d'H2O2 et/ou de NO nous permettra d'établir la fonction de régulation redox de chacune de ces enzymes. Avec la mise en évidence des mécanismes de la régulation de Srx et des sestrines, nous espérons pouvoir contrôler la signalisation d'H2O2 à une étape plus précoce que celle des péroxydases. Nous espérons aussi montrer que NO intervient sur la suroxydation par la modulation de Srx. Enfin, nous souhaitons valider l'hypothèse que NO produit par la NOS2 serait un relais entre les voies de signalisation du LPS (TLR, NF-?B) et de l'IFN-? (Jak/STAT) et la voie de la PI3K/Akt. L'évaluation de ces différents paramètres dans la même cellule, et dans le contexte d'une production physiologique de NO permettra de comprendre le mécanisme redox du cont...