– HumanBypass

Notre connaissance des mécanismes moléculaires de la mutagenèse a explosé depuis 1999 avec la découverte, dans les trois règnes de vivant, d'une nouvelle famille de polymérases spécialisées dans le recopiage des lésions de l'ADN. Ces enzymes sont capables de recopier toutes sortes de lésions avec un risque inhérent d'induction de mutations ponctuelles (Translesion synthesis: TLS). Par ailleurs, toutes les cellules possèdent d'efficaces mécanismes de contournement fidèle des lésions qui s'apparentent aux mécanismes de recombinaison homologues (Damage Avoidance : DA). Pourquoi les cellules humaines possèdent elles des mécanismes qui sont intrinsèquement mutagènes alors qu'existent des mécanismes efficaces fidèles ? En effet, s'il l'on peut imaginer que la mutagenèse contribue à l'évolution des bactéries voire des cellules germinales, il est difficile à comprendre pourquoi des mécanismes mutagènes, à priori uniquement néfastes, existent dans les cellules somatiques. Il est donc tout à fait essentiel de comprendre ces processus et leur contrôle afin de pouvoir éventuellement jouer sur l'équilibre entre TLS mutagène et DA. A terme, de telles études pourraient conduire à diminuer le taux de mutagenèse lié à l'exposition aux mutagènes endogènes ou exogènes. Soulignons aussi que ces polymérases ont un impact direct sur la santé humaine. En effet, l'une d'entre elles, Pol eta est reponsable de la maladie humaine Xeroderma Pigmentosum variant (XPV). En effet, Pol eta protège l'Homme de l'apparition du cancer de la peau, du fait de sa capacité exceptionnelle à recopier fidèlement les lésions pyrimidine-pyrimidine cyclobutane, lésions majeures induites par les UV. A ce jour Pol eta est l'unique exemple de polymérase spécialisée, sans doute, sélectionnée pour recopier fidèlement une lésion précise. Le but de notre projet est de découvrir les mécanismes moléculaires et éventuellement la signification biologique de la TLS chez l'Homme. En conditions normales, le génome est répliqué de façon très fidèle par les polymérase réplicatives. Ces enzymes sont en général bloquées par les lésions présentes dans l'ADN. Les cellules humaines contiennent de nombreuses polymérases « spécialisées ». Bien que ces enzymes soient capables de recopier des lésions de l'ADN in vitro, leur rôle in vivo n'a pas été établit excepté pour Pol eta (voir ci-dessus). De plus, certaines de ces polymérases sont impliquées dans la génération de la diversité au sein des gènes codant pour les immunoglobulines. Par conséquent, la compréhension du mécanisme moléculaire de la TLS est problème majeur tant sur le plan fondamental que médical. Notre projet s'articule en trois parties: 1. Analyse des processus de TLS et de DA dans les cellules. Analyse de la structure moléculaire des intermédiaires de réplication qui se forment quand une lésion bloque transitoirement la fourche de réplication. Pour ces études nous utiliserons une méthodologie dérivée de celle que nous avons récemment mise au point et utilisé chez E. coli (Pages and Fuchs, 2003 Science, 300, 1300-03). Nous espérons étudier l'effet de l'asymétrie de réplication (brin leading / lagging) sur le franchissement des lésions ainsi que la cinétique du processus.. L'utilisation de lignées cellulaires déficientes pour certaines polymérases nous permettra de définir la spécificité des voies de TLS en fonction de la nature des lésions. 2. Isolement de fourches de réplication bloquées in vivo. Nous allons mettre au point une nouvelle stratégie basée sur l'isolement des protéines fixées au niveau d'une fourche de réplication bloquée par une lésion. Pour cela nous allons introduire dans les cellules une vecteur plasmidique contenant une origine de réplication virale (SV40) ainsi que quelques lésions bloquantes distribuées sur le plasmide. Nous allons isoler les fourches de réplication bloquées en utilisant une approche de type biotin- streptavidin. Nous espérons ainsi mettre en évidence de nouveaux facteurs impliqués dans l...