– IVFproteomic

Le séquençage complet du génome a révolutionné les approches analytiques visant à identifier la fonction des gènes et comprendre les bases moléculaires de la vie. Dans le contexte de cette ère post-génomique, l'information contenue dans les séquences ADN du génome est cependant limitée pour la compréhension des processus complexes pathologiques et cellulaires, qui sont en général contrôlés par les molécules ARNs et les protéines. La protéomique a pour objectif l'assignation moléculaire et fonctionnelle des milliers de protéines encodées par le génome des organismes vivants. A cette fin, ce domaine de recherche en pleine effervescence a promu le développement et l'application de nouvelles méthodes pour l'analyse globale fonctionnelle du protéome. En 1999, le concept de profilage protéique utilisant des sondes ciblant le site actif d'enzymes (technique ABPP) a été développé pour le profilage d'expression et d'activité d'une classe de protéines dans les cellules, les tissus et les fluides biologiques. Dans ce type d'analyse ABPP, une sonde contenant une fonction azoture, et capable de se lier de manière covalente à sa cible est utilisée. Une culture cellulaire est traitée avec cette sonde et ensuite les cellules sont lysées. Le lysat protéique est alors traité avec un groupe chimique fluorophore qui réagit sélectivement avec la fonction azoture des sondes ABPP. Le lysat est ensuite analysé par électrophorèse sur gel, et les protéines modifiées par la sonde ABPP détectées et quantifiées. Cette technologie ABPP a été utilisée avec succès pour le profilage non-spécifique d'activité de sérine hydrolases, cystéine protéases, tyrosine phosphatases, glycosidases et métalloproteases dans diverses lignées cellulaires. L'objectif de notre projet est de développer une nouvelle approche analytique des cellules vivantes, combinant imagerie cellulaire et spectrométrie de masse. Cette nouvelle méthode représentera une extension importante du concept ABPP, étant compatible avec un panel plus large de protéines cibles et permettant la visualisation ultra sensible des localisations subcellulaires des protéines. Cette technique permettra 1) la caractérisation de l'activité des protéines dans leur environnement cellulaire, dans des situations physiologiques et pathologiques, 2) le profilage d'expression et d'activité, qualitatif et quantitatif, des protéines ciblées, 3) la caractérisation des complexes macromoléculaires impliquant les protéines ciblées. Cette nouvelle méthodologie de protéomique fonctionnelle in vivo s'appuie sur de nombreux éléments déterminants : - La sélection précise des protéines ciblées. Les sondes classiques ABPP ciblent habituellement des larges familles de protéine, ceci de manière non spécifique et ne sont donc pas compatibles avec notre approche d'imagerie cellulaire. Nous sélectionnerons des sous-familles (1 à 6-10 membres) avec une haute relevance biologique. - Le design de sondes chimiques contenant des groupes réactifs azoture. Ce projet nécessitera d'importantes étapes de synthèse organique de manière à obtenir des sondes fonctionnelles et sélectives, à partir de la structure d'inhibiteurs connus des protéines cibles. - L'utilisation de la réaction de ligation de Staudinger in cellulo, de manière à détecter très spécifiquement les protéines ciblées dans les structures cellulaires - L'utilisation de quantum dots. Ces nano-cristaux fluorescents possèdent d'excellentes propriétés pour l'imagerie, et sont hautement résistants au photoblanchiement. Des quantum dots décorés réagiront avec les sondes chimiques par une réaction de Staudinger, contribuant ainsi à la haute sensibilité de la technique. - L'utilisation de billes magnétiques décorées avec des groupes réactifs contre les sondes chimiques ABPP via une réaction de ligation de type Staudinger, de manière à séparer du lysat protéique les protéines ciblées ou les complexes macromoléculaires les impliquant. - L'utilisation combinée de deux méthodes d'analyse hauteme..