– RNACROSSTALK

Les petits ARNs de 20 à 27-nt sont des molécules régulatrices essentielles qui agissent comme des guides séquence-spécifiques dans de nombreux processus chez les eukaryotes: élimination d'ADN, assemblage de l'hétérochromatine, clivage des ARNm, et répression de la traduction. Quatre classes distinctes de petits ARNs endogènes ont été identifiés chez les plantes: i) microRNAs (miRNAs), ii) trans-acting siRNAs (ta-siRNAs), iii) natural cis-antisense RNA (nat-siRNAs), et iv) heterochromatin siRNAs (hc-siRNAs). Les miRNAs, ta-siRNAs et nat-siRNAs répriment l'expression génique au niveau post-transcriptionnel (PTGS), tandis que les hc-siRNAs contrôlent les éléments transposables au niveau transcriptionnel (TGS) et participent à l'assemblage de l'hétérochromatine. Chez la plante modèle Arabidopsis, ces quatre classes de petits ARNs sont produites par quatre enzymes RNaseIII distinctes qui clivent les dsRNAs (DICER-LIKE, DCL). Arabidopsis contient aussi cinq protéines avec un domaine de fixation aux dsRNAs (DRB), qui assistent les DCLs dans le processing, et dix protéines ARGONAUTE (AGO), qui s'associent aux petits ARNs et clivent les ARNm complémentaires (PTGS) ou guident le remodellage de la chromatine (TGS). DCL1, DRB1 et AGO1 agissent dans la voie des miRNAs, tandis que DCL4, DRB4, AGO1 et AGO7 agissent dans la voie des ta-siRNAs. La voie des nat-siRNAs nécessite DCL2, et la voie des hc-siRNA pathway nécessite DCL3 et AGO4. La fonction des autres DRBs et AGOs n'est pas connue. Une coordination entre TGS et PTGS a été constaté chez le nématode, chez lequel la régulation du RNAi (PTGS animale) nécessite de nombreux gènes chromatiniens. Chez les plantes, deux gènes chromatiniens sont impliqués dans la PTGS induite par des transgènes (travaux du Partenaire1). De plus, les siRNAs transgéniques, et au moins un miRNA, induisent la méthylation de l'ADN de leurs cibles. Toutefois, la régulation et le rôle biologique de ce processus ne sont pas compris. Récemment, le Partenaire1 a montré que la protéine SGS3 impliquée dans les voies PTGS/ta-siRNA interagit avec des protéines de la chromatine, renforçant l'hypothèse d'une coordination entre TGS et PTGS. Le Partenaire2 a montré que des ARNs dérivant des rétroposons SINE, qui sont contrôlés par des hc-siRNAs, interagissent avec DRB1. Le Partenaire2 a également montré que l'expression ectopique d'éléments SINE conduisait à des défauts de developpement qui peuvent être corrigés par la sur-expression de DRB4, suggérant d'autres connections entreTGS et PTGS. Dans ce projet, nous approfondirons l'étude de la coordination entre TGS et PTGS chez les plantes grâce à une combinaison d'approches génétiques et biochimiques: - La régulation des gènes MIR, TAS et SINE par la machinerie de TGS sera étudiée par analyse de l'accumulation des miRNAs, ta-siRNAs, siRNAs transgéniques et SINE hc-siRNAs matures, ainsi que leurs précurseurs, chez les mutants de TGS connus, les mutants affectés dans leurs paralogues, les mutants des partenaires chromatiniens de SGS3, et les doubles et triples mutants qui en dérivent. Cette approche étendra à la PTGS endogène nos précédents travaux portant sur la PTGS transgénique, identifiera le rôle des partenaires chromatiniens de SGS3, et élucidera la contribution des polymérases Pol II, Pol III et Pol IV à la transcription des SINE. - La régulation des SINE par la machinerie de PTGS sera étudiée par analyse de l'accumulation des intermédiaires et des hc-siRNAs matures chez tous les mutants de PTGS connus ainsi que leurs paralogues et les doubles et triples mutants qui en dérivent. Cette approche étendra nos précédents travaux portant sur la maturation des ARNs SINE et identifiera les fonctions de certains AGO et DRB. Nous exprimerons des versions étiquettées des cinq DRBs, purifierons les complexes RNP par immunoprécipitation, et charactériserons leurs composantes protéiques et ARNs. Cette analyse biochimique permettra de préciser l'implication des complexes DCL/DRB dans différentes voies (suggérée par l'analyse génétique des doubles mutants dcl), et l'interaction entre les DRBs impliquées dans la PTGS et les ARN SINE impliqués dans la TGS. - Le rôle et la regulation de la méthylation de l'ADN induite par des petits ARNs sera étudiée par analyse de l'expression et de la méthylation des cibles de miRNAs, ta-siRNAs, transgene-siRNAs et SINE-siRNAs chez les mutants de TGS connus, les mutants affectés dans leurs paralogues, les mutants des partenaires chromatiniens de SGS3, et les doubles et triples mutants qui en dérivent. Cette approche étendra aux cibles de la PTGS endogène nos précédents travaux portant sur les cibles de la PTGS transgénique, incluant les cibles des miRNAs et ta-siRNAs, ainsi que les gènes endogènes contenant des SINE inserrés dans leur séquence.