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Contexte scientifique et objectifs du projet La fenêtre thérapeutique entre la dose efficace et la dose toxique des médicaments anticancéreux est souvent très étroite. En effet, l'utilisation de doses médicamenteuses élevées requises a priori pour l'éradication des cellules tumorales se trouve proscrite en raison de la toxicité engendrée et de l'apparition de phénomènes de résistance. D'autre part, la tolérance et l'efficacité d'un traitement dépend d'une variabilité interindividuelle, qui peut selon que la posologie soit insuffisante ou excessive conduire à un traitement inefficace ou à une toxicité additive. Le projet associé à cette demande concerne l'une des classes médicamenteuses la plus couramment utilisée dans le traitement d'induction des leucémies et de certains syndromes lymphoprolifératifs, celle des analogues de nucléosides. Basé sur un certain nombre de résultats préliminaires, nous proposons ici de développer une méthodologie analytique originale permettant d'une part, de quantifier la dérégulation intracellulaire des concentrations en nucléoside/nucléotides endogènes induite par le processus de cancérogenèse. D'autre part, nous envisageons d'appliquer cette méthodologie au suivi pharmacologique d'un analogue nucléosidique modèle, l'araC, dans le but de mesurer directement la variation des concentrations intracellulaires de cet analogue et de ses métabolites phosphorylés en relation avec le polymorphisme des gènes impliqués dans l'action et la résistance à ce type de médicaments (transport, métabolisme…). Cette méthodologie, qui sera initialement développée dans des milieux biologiques modèles (extraits cellulaires, lignées tumorales), sera à terme appliquée à des échantillons cliniques. Dans ce cas, les travaux réalisés seront couplés à une étude par PCR quantitative permettant de corréler les valeurs obtenues aux niveaux d'expression des systèmes protéiques impliqués dans l'activité de ces agents thérapeutiques. La réalisation de ce projet implique un consortium pluridisciplinaire de quatre équipes dont les activités scientifiques couvrent les domaines de la chimie analytique, la recherche clinique en cancérologie et la biostatistique. Description du projet, méthodologie La quantification du contenu intracellulaire en nucléosides et nucléotides constitue un challenge important dans le domaine de l'analyse du fait de la sensibilité et de la sélectivité requises. Les méthodes existantes consistent à extraire et à concentrer les analytes d'intérêts via l'utilisation de la technique d'extraction en phase solide (SPE) suivi de leur analyse en chromatographie liquide (LC). Cependant, ces méthodes s'avèrent peu sélectives, d'autres composants de la matrice étant co-extraits et perturbant la détection et la quantification des analytes d'intérêts lors de l'analyse chromatographique. La spectrométrie de masse, de part la spécificité des détecteurs, est apparue comme la technique de choix pour contourner le problème de l'identification des analytes issus de matrices biologiques complexes. Cependant, des phénomènes de suppressions d'ions sont souvent observés en LC/MS et induisent une importante variabilité du phénomène d'ionisation d'un échantillon à l'autre. Dans ce projet, nous nous proposons dans un premier temps de développer de nouveaux supports d'extraction sélective (SSPE) basés sur la reconnaissance moléculaire et permettant d'isoler les analytes d'intérêts à partir de matrices biologiques complexes, augmentant ainsi la sélectivité et la sensibilité de la méthode. Deux types de supports seront étudiés, les immunoadsorbants obtenus à partir d'anticorps (IS) ou des polymères à empreinte moléculaire (MIP) comportant des cavités spécifiques des molécules cibles. Parallèlement à ces travaux, l'optimisation de la séparation chromatographique (choix de phases stationnaires et mobiles compatibles avec la MS) sera menée. Une fois le support d'extraction adéquat sélectionné, il sera couplé en ligne à l'outil LC/MS ou nanoLC/MS précédemment mis au point. La potentialité d'une telle technique on-line SSPE-LC-MS/MS sera alors évaluée pour sa capacité à doser les pools intracellulaires de nucléos(t)ides endogènes et cytotoxiques. Résultats attendus Les résultats attendus de ce projet sont multiples. D'un point de vue fondamental, ce projet devrait permettre d'accéder à une meilleure compréhension de l'incidence des variations en nucléos(t)ides endogènes dans le processus de cancérogenèse. La mise au point d'une technique d'analyse sensible et reproductive applicable au dosage intracellulaire d'un antileucémique comme l'araC et des métabolites phosphorylés permettrait de prendre en compte la variabilité interindividuelle et de détecter au plus tôt l'émergence de phénomènes de résistance.