– Cytoprotection

La mort cellulaire peut s'avérer pathologique dans diverses maladies, p.ex. les maladies neurodégénératives, les accidents vasculaires cérébraux ou les infarctus du myocarde. Un des mécanismes de mort cellulaire est l'apoptose, qui peut étre déclenchée par la voie dite «intrinsèque » (qui implique la perméabilisation de la membrane externe de la mitochondrie, PMEM) ou par les voies « extrinsèques » (soit par la ligation des récepteurs de la mort soit par l'absence de ligation de récepteurs à dépendance tels que DCC et UNC5H). La relation moléculaire entre la PMEM et la mort induite par les récepteurs à dépendance n'est pas connue. Au delà de la certitude que le PMEM est régulée par les protéines de la famille Bcl-2 et quelques unes des protéines contenues dans le PTPC (permeability transition pore complex), il n'y a pas eu d'étude systématique de la régulation de la PMEM. Nous proposons d'unifier les compétences de trois équipes spécialisées dans la signalisation pro-apoptotique mitochondriale(Guido Kroemer, P1), les récepteurs à dépendance (Patrick Mehlen, P3) et la recherche sur les small interfering RNAs (siRNAs, Annick Harel -Bellan P2). Ce projet, planifié pour une durée de 36 mois, poursuit quatre objectifs majeurs: - - 1. Cartographier les interactions fonctionnelles entre les récepteurs à dépendance et la voie mitochondriale menant à la mort cellulaire. P1 et P3 analyseront ensemble si la mort induite par les récepteurs à dépendance est accompagnée ou précédée par des signes de PMEM. Ils détermineront si des inhibiteurs connus de la MOMP (Bcl-2 et ses homologues, vMIA codé par le cytomégalovirus, ou des inhibiteurs chimiques du PTPC) suppriment la mort induite par les récepteurs à dépendance. Ils analyseront si des effecteurs établis de la MOMP (tels que Bax, Bak et cyclophiline D) sont nécessaires pour l'apoptose induite par les récepteurs à dépendance, dans plusieurs modèles de mort cellulaire provoquée par DCC ou UNC5H. - - 2. Identifier de nouveaux inhibiteurs de l'apoptose par criblage d'une banque de siRNAs couvrant la quasi-totalité du génome. P2 criblera une banque composée par des siRNAs ciblant 22000 différents gènes humains afin d'identifier des siRNAs capables d'inhiber l'apoptose induite dans deux différents modèles, le premier un modèle de signalisation de rédoxydation et le deuxième impliquant des médiateurs lipidiques du stress cellulaire (notamment céramide et ganglioside GD3). Un système de criblage fiable impliquant des lignées cellulaires humaines aisément tranfectables a déjà été optimisé par P1 et P2. Ce programme de criblage robotisé devra mener à l'identification de nouveaux gènes régulateurs de l'apoptose. Ces gènes et leurs produits seront validés par P1 et P2 et leur mode d'action sera investigué par P1. - - 3. Identifier de nouveaux inhibiteurs de l'apoptose par ciblage des composants de la cascade de signalisation autour de la PMEM et des récepteurs à dépendance. P1 établira un panel de siRNAs qui ciblent tous les composants connus du PTPC (et de nouveaux composants du PTPC qui seront identifiés par une approche protéomique) ainsi que les protéases qui pourraient être impliquées dans la libération mitochondriale de l'apoptosis inducing factor (AIF/PCD8). P3 établira un panel de siRNAs qui réduisent l'expression des composants (connus ou nouveaux) de l'interactome des récepteurs à dépendance. Ces siRNAs seront évalués dans une série de modèles appropriés d'apoptose induite via la voie mitochondriale ou les récépteurs de dépendance. - - 4. Valider l'utilité de nouveaux inhibiteurs de l'apoptose dans des modèles de mort neuronale. L'information obtenue par les approches détaillées ci-dessus sera soumise à une série de tests de validation ex vivo, sur des neurones primaires mourrant en absence de stimuli trophiques. Des siRNA ciblant les homologues murins des gènes humains cytoprotecteurs (voire points 3 et 4) seront synthétisés et ensuite évalués pour leur capacité d 'empêcher la mort