– NHEJ&TELO

Ce projet de recherche vise à comprendre les mécanismes moléculaires de la voie de réparation des cassures double-brin de l'ADN appelée NHEJ. En parallèle, ce projet vise à déterminer les mécanismes qui permettent aux télomères d'échapper à cette voie. Pour atteindre ces objectifs, nous utilisons une combinaison d'approches génétiques, moléculaires, biochimiques et structurales et focalisons notre attention sur un système modèle simple, la levure Saccharomyces cerevisiae. Ces fonctions ayant été relativement bien conservées au cours de l'évolution, ce travail aura un impact sur notre compréhension de la physiologie des cellules humaines, aussi bien dans un contexte normal que dans des pathologies comme le cancer. Dans la plupart des cellules, deux voies réparent efficacement les cassures double-brin de l'ADN : le NHEJ et la recombinaison homologue. Le NHEJ est essentiellement une religation directe des deux extrémités d'ADN. La recombinaison homologue est un processus plus complexe dans lequel une séquence homologue intacte est utilisée comme matrice pour la réparation. Le NHEJ et la recombinaison homologue ne sont pas deux voies en compétition : le NHEJ agit précocement après la formation d'une cassure double-brin et précède la recombinaison homologue temporellement. Les télomères sont les complexes ADN-protéines constituant les extrémités des chromosomes linéaires. Comme ce sont des extrémités double-brin d'ADN, les télomères pourraient être une cible des voies de réparation des cassures double-brin. En particulier, un événement de NHEJ entre deux télomères fusionnerait les chromosomes impliqués, générant un réarrangement pouvant initié un cycle d'instabilité génomique. Dans les cellules normales, le NHEJ est efficacement supprimé aux télomères et les événements de fusion entre télomères sont rares. Chez S. cerevisiae, la protéine se fixant aux séquences télomériques, appelée Rap1, est nécessaire à la suppression du NHEJ aux télomères. Puisque la présence de Rap1 aux télomères s'est conservée au cours de l'évolution jusqu'à l'homme, l'établissement de la suppression du NHEJ par Rap1 est potentiellement universel. Dans ce projet, nous proposons : * Un crible génétique et un système reconstitué in vitro pour trouver les nucléases impliquées dans le NHEJ. * Un nouveau système expérimental pour observer des réarrangements spécifiques de la chromatine aux extrémités des cassures double-brin et de tester leurs rôles dans le NHEJ. * D'identifier de nouveaux facteurs établissant la suppression du NHEJ aux télomères en aval de Rap1. * D'étudier les structures des protéines recrutées par Rap1 aux télomères pour révéler leurs fonctions moléculaires. Au cours du NHEJ, la modification d'extrémités non parfaitement cohésives implique que des nucléases et des polymérases soient recrutées pour corriger les mésappariements, éliminer les bases endommagées et remplacer les bases manquantes avant la ligation par la ligase du NHEJ, Lig4/Ligase IV. Ici notre objectif est de trouver à l'aide d'un crible génétique et d'un système reconstitué in vitro les nucléases utilisées par le NHEJ pour modifier les bases aux extrémités 3'. Nous essayerons alors de comprendre comment leur action est coordonnée avec celles de la polymérase et de la ligase dans le processus du NHEJ. NHEJ et recombinaison homologue agissent sur des substrats différents : des extrémités double-brin pour le NHEJ et des extensions 3' simple-brin pour la recombinaison homologue. Ici nous nous intéressons au comportement de la fibre nucléosomale, le premier niveau d'organisation de la chromatine, aux extrémités double-brin d'une cassure dont les brins 5' n'ont pas encore été dégradés, et qui donc restent un substrat pour le NHEJ. Un nouvel essai sera développé pour déterminer si la disposition des nucléosomes est réorganisée lors de la formation d'une cassure double-brin avant la dégradation du brin 5'. Puisque nous savons que la protéine télomérique Rap1 est nécessaire à la suppres...