– mRNA-decay

La NMD (Nonsense-Mediated mRNA Decay) est un mécanisme eucaryote qui permet de dégrader les ARNm contenant un codon stop précoce. Ces transcrits aberrants sont générés par des mutations, des erreurs de transcription ou d'epissage mais peuvent aussi dériver de réarrangements génétiques nécessaires pour générer la diversité des anticorps. La NMD protège la cellule contre la synthèse de protéines tronquées mais semble aussi réguler l'expression de certaines classes de gènes. Ce processus de «contrôle-qualité» des ARNm dépend de différents complexes protéiques qui reconnaissent les codons stop, discriminent les stop précoces des stop matures et activent la dégradation des ARNm. Bien que certains aspects de la NMD diffèrent selon les espèces, le mécanisme général est conservé et plus particulièrement la connexion entre les facteurs de terminaison, les facteurs Upfp, effecteurs de la NMD et la protéine de liaison à la queue poly(A). Cependant, le mécanisme précis d'activation de la NMD reste peu connu et sujet à controverse. Plus particulièrement, les interactions entre ces différents partenaires de la NMD sont toujours mal définies. Dans le but d'accéder aux détails moléculaires de cette voie de dégradation des ARNm aberrants, notre projet propose de définir les relations fonctionnelles et structurelles entre les différents effecteurs de la NMD, dans l'organisme modèle S. cerevisiae. 2- description du projet, méthodologie Dans cet objectif, nous proposons de: (i) Purifier les facteurs impliqués dans la NMD, individuellement ou sous forme de complexe; (ii) Définir leur structure par cristallographie ou par SAXS; (iii) Etudier par des approches génétiques et biochimiques les relations entre les différents partenaires. Les études structurelles seront menées par le groupe de Génomique Structurale de la Levure (YSG) à l'Université Paris Sud. Ce groupe a une solide expérience des techniques de surproduction des protéines de levure sous forme soluble, ainsi que des techniques de cristallisation de protéines isolées ou sous forme de complexes. Il profitera des techniques robotisées déjà développées dans ce but au laboratoire. Cette approche cristallographique sera combinée à des études par SAXS afin de modéliser les complexes en utilisant les données issues de la structure individuelle des protéines ou de leurs domaines. En parallèle, les études fonctionnelles seront conduites à l'IBPC (Paris). Les relations entre les partenaires de la NMD seront étudiées en isolant des mutants ayant perdu leur capacité à s'associer avec certains facteurs, par des méthodes génétiques de double-hybride et de double hybride inversée mais aussi en utilisant les données de structure. L'effet des différentes mutations sur la terminaison de la traduction, la dégradation des ARNm et la NMD sera ensuite analysé. La réalisation de ce projet sera favorisée grâce au recrutement de deux chercheurs CNRS. Stéphanie Kervestin a rejoint le groupe de l'IBPC, après 2 ans de travail postdoctoral dans l'équipe d'Allan Jacobson (USA), un des experts dans le domaine de la NMD, avec qui des collaborations seront menées. Marc Graille a été recruté dans le groupe YSG. Il possède une grande expérience des complexes protéiques et a déjà résolu la structure de deux complexes hétérodimériques en collaboration avec le groupe de l'IBPC. 3- résultats attendus Ce projet a pour but de définir la structure du complexe de surveillance Upf1-Upf2-Upf3. Ces resultats aiderons à comprendre l'interaction entre ces protéines et les facteurs de terminaison. En parallèle, les données biochimiques nous permettront d'accéder aux détails de l'activation et de la régulation du complexe de surveillance par les facteurs de terminaison et la protéine de liaison à la queue poly(A) des ARNm. La coordination de ces deux approches devrait conduire à une meilleure compréhension de la NMD pour définir un mécanisme précis de cette voie.