ETUDES STRUCTURALES ET FONCTIONNELLES DE snRNP REGULATRICES DE LA TRANSCRIPTION – TrscrREGsnRNP

De l'ARN comme régulateur de la transcription Un ensemble de découvertes réalisées au tournant du siècle ont attiré l'attention sur l'implication d'ARNs nucléaires non-codants dans la transcription eucaryote. L'une des observations décisives fut rapportée en 2001 par le partenaire 1 et le groupe de Qiang Zhou à Berkeley. Les deux équipes ont alors montré que l'ARN 7SK était associé à une forme inactive du facteur P-TEFb(Positive Transcription Elongation Factor). Bien que l'ARN 7SK ait été décrit en 1976 et qu'il soit l'un des ARNs les plus abondants dans le noyau, son rôle était resté énigmatique. Depuis ce rapport initial, il a été proposé que l'ARN U1 active le facteur général de transcription TFIIH et que l'ARN B2 inhibe l'ARN polymérase II lors d'un stress, évoquant ainsi l'action de l'ARN 6S sur l'ARN polymérase d'E.coli. Ces découvertes ont ouvert un nouveau champ de recherches très compétitif. Des facteurs régulateurs de l'élongation Les facteurs NELF (Negative Elongation Factors) préviennent l'allongement des transcrits au delà de quelques centaines de nucléotides après l'initiation, ce qui introduit une pause de l'élongation. L'activité du P-TEFb est requise pour lever cette pause. Le P-TEFb est constitué d'une kinase CDK9, et d'une Cycline T. CDK9 phosphoryle le domaine CTD de l'ARN polymérase II ainsique des sous-unités des NELF. En conséquence, le blocage dû aux NELF est aboli et des facteurs, essentiels pour la maturation des transcrits (épissage, clivage/terminaison,...) sont recrutés sur le complexe de transcription. De l'ARN 7SK dans des complexes inactifs du P-TEFb. Deux formes de P-TEFb sont présentes dans des extraits de cellules de mammifère. Un «petit» complexe actif de P-TEFb est constitué de CDK9 et de Cycline T1 ou T2. La forme inactive du P-TEFb se trouve au sein d'un «grand» complexe associée à une protéine, HEXIM1, elle-même associée à l'ARN 7SK. Un arrêt global de la transcription ou une stimulation hypertrophique decellules cardiaques provoquent la dissociation du «grand» complexe P-TEFb/HEXIM1/7SK en «petit» complexe. Inversement, l'association du 7SK à HEXIM1 entraîne un changement de conformation provoquant son association à la Cycline T1(ou T2) et il s'ensuit une inactivation de CDK9. Les trois équipes partenaires prévoient d'unir leurs compétences complémentaires en biochimie, en biologie structurale et en biologie du développement. Leur objectif principal est de comprendre comment s'opère la commutation de P-TEFb entre formes actives ou inactives. Caractérisation structurale et fonctionnelle de 7SK snRNPs Du fait des contributions de nombreux laboratoires, l'inactivation du P-TEFb par l'ARN 7SK est devenu un paradigme de la fonction des ARNs non-codants dans la transcription. Cependant, plusieurs questions fondamentales demeurent non résolues et seront étudiées dans ce projet.Une étude en imagerie par microscopie électronique, devrait permettre d'obtenir les premières données concernant l'architecture de P-TEFb. La protéine HEXIM1 forme des oligomères à la stoechiométrie incertaine très asymétriques pouvant servir de plateforme à un nombre égal de CDK9 et de Cycline T. Quels sont les déterminants de la reconnaissance de l'ARN 7SK par la protéine HEXIM1? On recherchera systématiquement des mutants protéiques défectifs pour l'interaction avec l'ARN dans un test triple-hybride. On cartographiera les interactions après un couplage covalent. Cependant, une étude cristallographique s'impose pour comprendre comment la fixation d'un ARN sur HEXIM1 entraîne un changement majeur de l'activité de CDK9 malgré l'absence de contacts directs entre ces deux protéines. Les structures de plusieurs CDK et de leurs inhibiteurs ont déjà été résolues. CDK9 est la seule connue pour être régulée par un ARN. La détermination de la structure de ce nouveau type de snRNP est un défi à relever. Intégration du système dans la cellule. Des «grands» et des «petits» complexes de P-TEFb sont observés dans des extraits cellula