– RIBEUC

La synthèse des ribosomes est l'une des activités métaboliques majeures de toute cellule. Chez les eucaryotes, elle comprend la synthèse de 4 ARN ribosomiques (ARNr) qui vont devoir être correctement maturés, repliés et assemblés avec environ 80 protéines ribosomiques. Ces processus se déroulent au sein de particules pré-ribosomiques, qui migrent du nucléole au nucléoplasme puis sont exportées vers le cytoplasme au travers des pores nucléaires. Ces étapes nécessitent l'action concertée des machineries transcriptionnelles contenant les ARN polymérase Pol I, Pol II et Pol III, approximativement 80 petites particules ribonucléoprotéiques et 200 protéines dites « non-ribosomiques » associées transitoirement aux particules pré-ribosomiques. Plusieurs aspects cruciaux de la synthèse des ribosomes eucaryotes restent très mal compris. Les modes d'action précis de la plupart des ces protéines non-ribosomiques restent inconnus. Les activités des machineries Pol II et Pol III sont coordonnées avec celle de Pol I, mais les mécanismes mis en jeu sont peu clairs. Des étapes post-transcriptionnelles de la synthèse des ribosomes sont reliées à la progression du cycle et l'initiation de la traduction, mais ces liens ont été peu explorés. Les buts de ce projet sont d' (i) obtenir des renseignements mécanistiques concernant des étapes clés de la synthèse des ribosomes eucaryotes (ii) identifier comment la cellule évalue l'exécution de ces étapes et élimine les pré-ribosomes défectueux (iii) étudier comment ces étapes sont reliées à l'initiation de la traduction et la progression du cycle. Nous allons tout d'abord étudier comment la machinerie RNA Pol I peut orchestrer la transcription des gènes codant des ARNt (transcrits par l'ARN Pol III) et des protéines ribosomiques (transcrits par l'ARN Pol II) et comment cette régulation est liée au positionnement dans l'espace. Nous rechercherons des facteurs qui établissent un lien entre la machinerie Pol I et les machineries Pol II et Pol III. Nous caractériserons le positionnement dans l'espace et la dynamique des gènes codant des ARNr, des ARNt et des protéines ribosomiques et comment ces paramètres sont affectés par l'inhibition des facteurs liés à la machinerie Pol I identifiés précédemment. Cette étude sera effectuée par microscopie en temps réel avec des cellules vivantes contenant des loci génétiques fluorescents couplée à une analyse d'images avec un logiciel et un traitement mathématique ad hoc. Nous effectuerons également une étude en profondeur du mode d'action d'enzymes potentielles associées aux particules pré-ribosomiques. Nous identifierons les partenaires directs d'hélicases potentielles de la famille des protéines DEAD/H. Nous rechercherons les substrats des kinases Rio1p et Rio2p, essentielles à des étapes tardives de la maturation des particules pré-ribosomiques pré-40S. Nous étudierons le rôle de plusieurs enzymes potentielles lors d'étapes tardives de la synthèse de la sous-unité ribosomique 60S et comment ces étapes sont Iiées au transport nucléo-cytoplasmique et l'initiation de la traduction. Les étapes post-transcriptionnelles de la synthèse des ribosomes ont jusqu'à présent été peu explorées chez les eucaryotes supérieurs. Nous entreprendrons une étude détaillée de la formation de la sous-unité ribosomique 40S dans des cellules de mammifères. Nous analyserons les rôles d'homologues mammifères de protéines de levure impliquées dans ce processus et son organisation ultra-structurale par des approches avancées de microscopie électronique. Un système de surveillance qui détecte et dégrade des particules pré-ribosomiques défectueuses a récemment été découvert. Nous rechercherons des facteurs qui adressent ces particules vers la machinerie de dégradation. Pour cela, nous rechercherons de manière systématique des facteurs associés à des composants connus de la machinerie de dégradation. Nous déterminerons aussi précisément le positionnement de cette machinerie au sein du nucléole lor