ISNATOX Production de standards internes de toxines d'origine naturelle uniformément enrichis par des isotopes stables. Production of U13C internal standard of naturally occuring toxins – ANR-05-SEST-0012

Le dosage précis de composés exogènes toxiques ou non au sein d'organismes, dans l'alimentation ou l'environnement, nécessite l'utilisation de standards internes (SI). Les méthodes les plus sensibles de détection aujourd’hui utilisent le couplage HPLC-MSn. Pour détecter le composé recherché, souvent hautement dilué dans des matrices complexes, le SI doit mimer au mieux le comportement physico-chimique du composé à quantifier (partition entre les phases en milieu hétérogène, caractéristiques spectroscopiques etc.), donc être de structure la plus proche possible, et en outre être facilement détectable à faible concentration. Une solution efficace consiste à prendre comme SI la molécule recherchée elle-même, mais marquée par des isotopes naturellement peu abondants. Le marquage radioactif est une approche actuellement employée, mais pose des problèmes de manipulation, d'éthique et de déchets. Dans le cadre du programme de recherche "environnement et santé 2002", nous avons développé une méthode basée sur l’incorporation d’isotopes stables, au travers de l’exemple de la biosynthèse de mycotoxines uniformément enrichies en carbone 13C (10% de 13C). Cette méthode repose sur la culture sous atmosphère enrichie en 13C CO2 (10 %) de l’organisme-hôte (plante) sur lequel l’organisme fongique producteur de la mycotoxine se développe ensuite, produisant le composé souhaité. L'amas isotopique des molécules obtenues est caractéristique du produit uniformément enrichi à 10% de 13C, conformément à la prédiction, et permet la détection du composé recherché non marqué avec une différenciation raisonnable. Toutefois, du fait du faible taux d’enrichissement isotopique utilisé, la méthode de biosynthèse employée conduit à la formation d'une part non négligeable de molécules entièrement 12C, ce qui impose une opération de déconvolution pour séparer les amas isotopiques du composé à étudier et du SI,. L'analyse des résultats nécessite une mesure des rapports isotopiques postérieure à l'analyse par HPLC-MS et pose un problème de limite de détection au cours de l'analyse et de fait n’est pas en accord avec les guidelines de quantification élaborés par la FDA. Afin d'éliminer cet inconvénient et de démontrer la faisabilité et la pertinence de cette approche dans le cadre d'études réglementaires, de contrôles alimentaires ou environnementaux, nous souhaitons produire des SI contenant moins de 0.01% de composé entièrement 12C, donc plus nettement différencié sur l‘analyse de masse. Dans ces conditions, les SI pourront être utilisés dans des matrices complexes tout en simplifiant les étapes de validation des procédures d'extraction et quantification. Cette technique d'analyse sera directement applicable à la détermination de seuils d'exposition et de dosage de contaminants dans les aliments ou l'environnement. Compte tenu du coût de production des SI marqués et de leurs précurseurs dans les conditions d’enrichissement à 50 ou 100%, nous démontrerons la faisabilité de la méthode sur la détection d’un toxique modèle, la zéaralénone, produite par Fusarium graminearum et actuellement recherchée dans les viandes et aliments du bétail. Dans le présent appel d’offres, nous demandons le soutien financier spécifique à ces opérations de marquage uniforme, sans moyens humains, pour démontrer la pertinence de cette technique d'analyse, et intéresser plus tard le milieu professionnel impliqué. La durée du programme de deux ans prend en compte le temps des cultures, qui est incompressible.