Anticorps anti-FVIII catalytiques au cours de l'hémophilie : études structurales et implications thérapeutiques – CATAB

L’hémophilie A est une maladie récessives liée au chromosome X qui touche un enfant mâle sur 5000 et se traduit par des niveaux plasmatiques insuffisants de FVIII fonctionnel. L’administration thérapeutique de FVIII exogène aux patients hémophiles résulte dans environ 20% des cas dans le développement d’anticorps anti-FVIII. Ces anticorps inhibent l’activité procoagulante du FVIII par encombrement stérique. La survenue d’anticorps anti-FVIII inhibiteurs rend l’administration ultérieure de FVIII inutile et expose les patients à un risque de mortalité accru. Nous avons décrit un nouveau mécanisme d’inhibition du FVIII par les anticorps: les anticorps de certains patients hydrolysent le FVIII (Nat Med, 1999). Ces anticorps protéolytiques sont retrouvés chez plus de 50% des patients hémophiles sévères, ce qui suggère leur importance clinique dans l’inactivation du FVIII (New Eng J Med, 2002). Nous souhaitons ici caractériser l’activité catalytique des anticorps anti-FVIII d’un point de vue structural dans une perspective thérapeutique. Nous déterminerons les mécanismes moléculaires de l’hydrolyse du FVIII par les anticorps des patients. Les sites de clivage seront identifiés par séquençage des fragments de digestions. Le paramètres cinétiques qui caractérisent l’activité hydrolytique des IgG des patients seront calculés à l’aide de FVIII biotinylé et de substrats génériques. Afin de mieux comprendre la structure des sites actifs et la nature des mécanismes enzymatiques impliqués, nous identifierons les gènes codant les régions variables (V) des anticorps protéolytiques. Nous produirons des anticorps monoclonaux protéolytiques en immunisant des souris MLR-lpr et des souris humanisées avec du FVIII recombinant humain. Nous préparerons également des fragments Fab recombinants anti-FVIII à partir des lymphocytes B mémoire circulants de patients. La caractérisation des sites de clivage et des paramètres cinétiques, le séquençage des gènes codant les régions V, la modélisation tridimentionnelle des régions V et des sites catalytiques seront faits au fur et à mesure de la génération des anticorps monoclonaux et des fragments Fab. Nous identifierons des peptides capables de bloquer spécifiquement l’activité protéolytique des anticorps anti-FVIII. Nous criblerons des peptides aléatoires exprimés par des phages à l’aide des anticorps anti-FVIII polyclonaux de patients hémophiles A ou atteints d’hémophilie acquise, et à l’aide d’anticorps monoclonaux ou de fragments Fab catalytiques. L’activité neutralisante des peptides sera confirmée in vitro à l’aide d’approches immunochimiques et de tests de coagulation, et in vivo à l’aide du modèle murin d’hémophilie. Des anticorps anti-FVIII inhibiteurs surviennent en tant qu’autoanticorps chez les patients atteints d ‘hémophilie acquise. De même, le traitement des patients atteints d’hémophiles B entraine la survenue d’alloanticorps anti-FIX. Nous rechercherons la présence d’IgG hydrolysant le FVIII et le FIX chez les patients atteints d’hémophilie acquise et d’hémophilie B, respectivement. Le projet proposé permettra de mieux connaître les propriétés enzymatiques des anticorps catalytiques anti-FVIII et leur importance physiopathologique. De plus, il devrait permettre de confirmer l’importance de l’hydrolyse du FVIII comme mécanisme d’inactivation du FVIII. Ce travail débouchera sur de nouvelles approches du traitement des inhibiteurs du FVIII.