Puces à ARN - La nouvelle génération – RNArrays TNG

Puces à ARN La nouvelle génération

Le besoin d’une méthode qui permette une analyse mutationnelle à grande échelle mais précise des molécules d'ARN fonctionnelles est grandissant. Le contrôle de séquences à synthétiser offre également la perspective de la préparation de bibliothèques d'ARN pour des approches de séquençage de troisième génération. La synthèse combinatoire aléatoire d'ARN ne peut pas répondre à ces critères, mais la synthèse photolithographique à haute densité de RNA arrays (réseaux d’ARN) fournit une vraie solution. Cependant, la seule méthode actuellement disponible pour la synthèse de RNA arrays in situ est limitée en termes de débit en raison des longs temps de couplage et de photodéprotection ainsi que de la dégradation pendant les étapes de déprotection.

Notre objectif est de développer deux nouveaux ensembles de phosphoramidites d'ARN pour la fabrication de RNA arrays avec des temps de couplage plus rapides, une photosensibilité accrue et des stratégies de déprotection plus douces, et ainsi d'accéder à de longs oligonucléotides d'ARN de haute qualité en des courts temps de synthèse. Nous avons ensuite l'intention de préparer des puces à ARN pour des applications sur et hors surface, de l'étude des propriétés fluorogéniques d'un aptamère d'ARN spécifique au séquençage direct de bibliothèques d'ARN sur un instrument Nanopore. Les deux ensembles de phosphoramidites ayant une sensibilité différente à la déprotection en milieu basique, les groupements en 2'-OH peuvent être maintenus à des emplacements particuliers pour étudier le rôle du groupe hydroxyle 2 'dans l'ARN fonctionnel.

Nous transformerons les 2'-O-pivaloyloxyméthyl (PivOM) et propionyloxyméthyl (PrOM) ribonucléosides disponibles dans le commerce, initialement développés dans notre groupe, en leurs versions 5 'hautement photosensibles et nous préparerons les huit phosphoramidites correspondants. L'incorporation de ces phosphoramidites dans des réseaux d'ARN se fera par photolithographie in situ. L'aptamère Mango III sera synthétisé sur puce et analysé face au thiazole orange et les bibliothèques de séquences seront lues d'abord sur Illumina, puis sur un Nanopore GridION.

Ce faisant, nous nous attendons à ce que la synthèse d'ARN se déroule 3 à 4 fois plus rapidement et surmonte ainsi la limitation actuelle d’obtenir des oligomères de ~ 30 nt, jusqu'à 100 nt de long. Avec un faible taux d'erreur de synthèse, cette approche pourrait alors être considérée comme une excellente source de diversité contrôlée de séquences. Une mutation systématique et à grande échelle sera extrêmement utile dans la recherche sur les aptamères et les ribozymes.

Il s'agit d'une collaboration internationale entre le groupe «Oligonucléotides modifiés» de l'IBMM à l'Université de Montpellier, France et le groupe «Chimie des acides nucléiques» à l'Université de Vienne, Autriche, avec les Drs Françoise Debart (France) et Jory Liétard (Autriche) en tant que coordinateurs conjoints et responsables scientifiques. La synthèse des huit nouveaux phosphoramidites pour la synthèse d’ARN sera réalisée en France. La synthèse de puces à ARN et toutes les applications qui en découleront seront effectuées en Autriche.