Puces à ARN - La nouvelle génération – RNArrays TNG

1. Synthèse des phosphoramidites
Un set de 4 ribonucléosides phosphoramidites 2'-O-PivOM 5'-O-NPPOC et
un set de 8 ribonucléosides phosphoramidites 2'-O-PrOM 5'-O-NPPOC ou 5'-O-SPhNPPOC ont été préparés par une voie de synthèse en 5 étapes à partir de ribonucléosides commerciaux, déjà protégés sur les bases par des groupes acyles, en 2'O par un groupe PivOM ou PrOM et en 5'O par un groupe temporaire diméthoxytrityle. Les protections photosensibles NPPOC ou SPhNPPOC ont été introduites régiosélectivement en 5'OH après protection transitoire du 3'OH par un groupe silyle et déprotection du 5'OH. Le réactif NPPOC-Cl a dû être préparé au préalable au laboratoire alors que son dérivé thiophényle a été acheté. Après libération des 3'OH des groupes silyles, la fonction phosphoramidite a été installée sur les ribonucléosides avec de bons rendements. Plusieurs grammes de chaque ribonucléoside phosphoramidite ont pu être obtenus et fournis au partenaire autrichien pour les incorporer dans des séquences d'ARN sur puces.
2. Synthèse des puces à ARN
Evaluation du couplage des différents phosphoramidites et dégradation des ARN

Evaluation de la photolyse des groupes NPPOC et SPhNPPOC sur un ARN de 25 nucléotides de long.

Les chimistes de l'équipe de Montpellier ont développé de nouveaux blocs de construction pour améliorer la synthèse d’ARN sur puces par photolithographie effectuée par les partenaires de l'équipe de Vienne. Ceux-ci consistent en des ribonucléosides phosphoramidites inédits, protégés en 2’OH par un groupe acetalester (pivaloyloxymethyl (PivOM) ou propionyloxyméthyle (PrOM), initialement développé pour la synthèse d’ARN sur support solide, et en 5’OH par un gourpe photolabile (NPPOC ou SPhNPPOC)
- les synthons 2'-O-PivOM 5'-O-NPPOC n'ont pas permis d'obtenir des ARN de bonne qualité avec efficacité donc ont été écartés pour la suite du projet.
- les phosphoramidites 2'-O-PrOM 5'-O-SPhNPPOC ont montré des efficacités de couplage supérieures aux phosphoramidites 2'-O-ALE de la 1ere génération de puces à ARN. Moins de dégradation d'ARN a été observée.

L’utilisation de ces protections PrOM et SPhNPPOC a permis de réduire de plus de la moitié le temps de couplage des unités entre elles par rapport à des protections traditionnelles, tandis que le temps de photolyse a pu être divisé par 4. Des bibliothèques de séquences d’ARN dont la synthèse aurait pris plus de six heures peuvent désormais être préparées en deux fois moins de temps.
Grâce à une synthèse plus rapide et plus efficace, des micropuces à ARN contenant plus d’une dizaine de milliers de variants d’aptamères fluorogènes sur la même surface ont été fabriquées. Ces puces ont ensuite été soumises à un seul et unique test d’interaction avec un marqueur fluorescent, lequel a révélé comment des mutations et des troncations sur des séquences d’aptamères connus peuvent largement diminuer ou augmenter leur propriétés fluorogéniques.

Cette optimisation de la synthèse de puces à ARN par photolithographie représente une avancée technologique majeure en terme de qualité, efficacité et rapidité. Avec un faible taux d'erreur synthétique, cette méthode permettra la synthèse de bibliothèques d'oligonucléotides ARN longs (>100 nucléotides) et complexes sur des puces à haute densité, pour le séquençage direct de l'ARN et étudier le taux d'erreur de la synthèse de l'ARN.

Avec l'amélioration de la chimie et de la photochimie de la photolithographie de l'ARN, il devient maintenant possible d'envisager la préparation de puces décorées avec des molécules d'ARN fonctionnelles plus grandes, telles que l'ARNt, les ARN guides et les ARNzymes, qui étaient tout simplement hors de portée avec la chimie ALE. En outre, les précurseurs 5'-DMTr 2'-O-PrOM ribonucleosides naturels ou avec des bases unusuelles (5-methyl-cytosine, hypoxanthine, 6-methyladenine), disponibles dans le commerce constituent une passerelle utile vers la synthèse d'ARN phosphoramidites modifiés sur les bases ou d'ARN 5'-phosphoramidites «inverses« 3'-photoprotégés, qui devraient devenir la prochaine mise à niveau de la boîte à outils chimiques de la synthèse de puces sans masque.

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Puces à ARN La nouvelle génération

Le besoin d’une méthode qui permette une analyse mutationnelle à grande échelle mais précise des molécules d'ARN fonctionnelles est grandissant. Le contrôle de séquences à synthétiser offre également la perspective de la préparation de bibliothèques d'ARN pour des approches de séquençage de troisième génération. La synthèse combinatoire aléatoire d'ARN ne peut pas répondre à ces critères, mais la synthèse photolithographique à haute densité de RNA arrays (réseaux d’ARN) fournit une vraie solution. Cependant, la seule méthode actuellement disponible pour la synthèse de RNA arrays in situ est limitée en termes de débit en raison des longs temps de couplage et de photodéprotection ainsi que de la dégradation pendant les étapes de déprotection.

Notre objectif est de développer deux nouveaux ensembles de phosphoramidites d'ARN pour la fabrication de RNA arrays avec des temps de couplage plus rapides, une photosensibilité accrue et des stratégies de déprotection plus douces, et ainsi d'accéder à de longs oligonucléotides d'ARN de haute qualité en des courts temps de synthèse. Nous avons ensuite l'intention de préparer des puces à ARN pour des applications sur et hors surface, de l'étude des propriétés fluorogéniques d'un aptamère d'ARN spécifique au séquençage direct de bibliothèques d'ARN sur un instrument Nanopore. Les deux ensembles de phosphoramidites ayant une sensibilité différente à la déprotection en milieu basique, les groupements en 2'-OH peuvent être maintenus à des emplacements particuliers pour étudier le rôle du groupe hydroxyle 2 'dans l'ARN fonctionnel.

Nous transformerons les 2'-O-pivaloyloxyméthyl (PivOM) et propionyloxyméthyl (PrOM) ribonucléosides disponibles dans le commerce, initialement développés dans notre groupe, en leurs versions 5 'hautement photosensibles et nous préparerons les huit phosphoramidites correspondants. L'incorporation de ces phosphoramidites dans des réseaux d'ARN se fera par photolithographie in situ. L'aptamère Mango III sera synthétisé sur puce et analysé face au thiazole orange et les bibliothèques de séquences seront lues d'abord sur Illumina, puis sur un Nanopore GridION.

Ce faisant, nous nous attendons à ce que la synthèse d'ARN se déroule 3 à 4 fois plus rapidement et surmonte ainsi la limitation actuelle d’obtenir des oligomères de ~ 30 nt, jusqu'à 100 nt de long. Avec un faible taux d'erreur de synthèse, cette approche pourrait alors être considérée comme une excellente source de diversité contrôlée de séquences. Une mutation systématique et à grande échelle sera extrêmement utile dans la recherche sur les aptamères et les ribozymes.

Il s'agit d'une collaboration internationale entre le groupe «Oligonucléotides modifiés» de l'IBMM à l'Université de Montpellier, France et le groupe «Chimie des acides nucléiques» à l'Université de Vienne, Autriche, avec les Drs Françoise Debart (France) et Jory Liétard (Autriche) en tant que coordinateurs conjoints et responsables scientifiques. La synthèse des huit nouveaux phosphoramidites pour la synthèse d’ARN sera réalisée en France. La synthèse de puces à ARN et toutes les applications qui en découleront seront effectuées en Autriche.