DS0401 -

Déterminants moléculaires et mécanique membranaire impliqués dans la neogénèse des pores nucléaires – NeoPore

Déterminants moléculaires et mécanique membranaire mis en jeu dans la néogénèse des pores nucléaires

Le but de ce projet est de comprendre la séquence d'évènements aboutissant à l'assemblage de pores nucléaires grâce à la microscopie corrélative AFM/dSTORM sur des enveloppes nucléaires purifiées. Ces deux techniques de microscopie ont des résolutions similaires de l'ordre du nanomètre et seront combinées à des approches de biologie cellulaire permettant d'interférer avec des étapes spécifiques de l'assemblage des pores.

Enjeux et objectifs

Dans les cellules eucaryotes, l’enveloppe nucléaire (EN) isole le matériel génétique du reste de la cellule. Cette double bicouche lipidique comprend les membranes nucléaires interne (MNI) et externe (MNE), séparées par un lumen appelé espace périnucléaire (PNS). Ancrés dans l’EN, les pores nucléaires (NPCs) sont les seuls passages entre le noyau et le cytoplasme. Ils sont situés à des points de fusion entre les MNI et MNE.?En interphase, les cellules dupliquent leurs constituants cellulaires. Ces mécanismes, à l’exception de la réplication de l’ADN, sont peu explorés. La formation des NPCs en interphase est un processus complexe combinant assemblage macromoléculaire et remodelage des membranes nucléaires. Cela nécessite la fusion locale des MNE et MNI. Pour cela, les deux membranes doivent se rapprocher, générant localement une combinaison complexe de courbures positive et négative dans les bicouches. Notons que la plupart des mécanismes de déformation membranaire induisent des déformations convexes, c’est-à-dire une augmentation surfacique du feuillet membranaire en contact avec les agents de courbure. D’ailleurs, des protéines impliquées dans l’assemblage des NPCs en interphase induisent des déformations convexes sur des liposomes synthétiques. Pourtant, la déformation nécessaire à la formation des pores est concave. Cette divergence n’est pas comprise.? <br />Notre projet se décompose en trois axes : <br />1. Obtenir des informations simultanées sur la composition et la topographie d’intermédiaires de formation de NPCs par microscopie corrélative dSTORM/AFM. <br />2. Comprendre les mécanismes moléculaires qui permettent une courbure concave de la membrane nucléaire dans le contexte de la formation des NPCs. <br />3. Déterminer la combinaison minimale de facteurs nécessaires pour induire la fusion de deux bicouches parallèles et l'assemblage de constituants des NPCs dans des membranes ectopiques.

- Biologie cellulaire : culture cellulaire, transfection transitoire ou stable avec des protéines fluorescentes et/ou des siRNAs, immuno-fluorescence.
- Microscopies de fluorescence : microscopie confocale, STED, TIRF
- AFM
- Logiciels d’analyse: Huygens (déconvolution), ImageJ, MatLab, Gwyddion (analyse d’AFM)

1) Mise en place de la microscopie AFM-Fluo sur des ENs isolées à partir de cellules en culture. Cet objectif a été atteint sur des noyaux isolés à partir de cellules en culture, déposés sur lames de verre puis ouverts, fixés et marqués avec des anticorps spécifiques des NPCs. Les noyaux sont ensuite imagés en AFM avec des résolutions latérale et axiale de l’ordre du nanomètre.
2) Identification des intermédiaires de formation des NPCs et analyse de leur topographie. La microscopie corrélative AFM/Fluo permet de repérer les NPCs en cours de formation et de les imager par AFM. Différentes structures correspondant sans doute à différents stades de formation des NPCs, ont été observées par AFM.
3) Quantification du nombre d’intermédiaires de formation des pores par imagerie confocale, déconvolution, détection automatique des NPCs. Un marquage différentiel permet de quantifier le nombre d’intermédiaires de formation des NPCs dans des cellules où la formation des pores est inhibée par différents siRNAs. Ceci permet en première approximation de distinguer les facteurs impliqués dans les phases précoces ou tardives d’assemblage des NPCs..
4) Microscopie STED sur les pores nucléaires sur des cellules marquées par des anticorps spécifiques des pores nucléaires. Le STED permet de mesurer des différences de structure entre les pores matures et des intermédiaires de formation.
5) Rôle de la protéine SUN1 dans l’assemblage des NPCs, en relation avec son rôle dans la structuration de l’EN. SUN1 est essentielle à l’assemblage des NPCs en interphase, par un mécanisme inconnu. Nous explorons comment son rôle de maintien structurel de l’EN est connecté à son rôle dans la formation des pores. Pour cela, nous utilisons une série de mutants de SUN1 affectant les propriétés de l’EN. Nous étudions l’effet de ces mutants en parallèle sur l’assemblage des pores et sur la structure de l’EN.

- Mise en place du dSTORM sur les NPCs afin d’imager les noyaux en AFM/dSTORM. Le setup permettant cette imagerie corrélative est déjà opérationnel. Seules les conditions d’imagerie spécifiques aux NPCs doivent être mises en place.
- Clonage de composants des NPCs en fusion avec des tags HALO ou SNAP, permettant des marquages fluorescents compatibles avec le dSTORM : La majorité des sous-unités des NPCs ne peuvent pas être marquées par immuno-fluorescence dans des conditions compatibles avec la microscopie en molécule unique. Nous établirons une série de lignées stables exprimant des combinaisons de sous-unités en fusion avec les tags HALO et SNAP. Nous conjuguerons ces protéines avec des ligands couplés à des sondes Janelia Fluor permettant la microscopie en molécule unique.
- Analyse en STED de la structure des intermédiaires de formation des NPCs après traitement des cellules par différents siRNAs. Cette étude préliminaire nous permettra d’affiner les conditions les plus prometteuses pour l’AFM/dSTORM. En effet, le STED permet une approche beaucoup plus rapide et plus systématique que l’AFM et/ou le dSTORM.
- Analyse en AFM de la structure des intermédiaires de formation des NPCs après traitement des cellules par des siRNAs sélectionnés au cours de l’étude en STED.
- Analyse en AFM/dSTORM de la structure d’intermédiaires de formation des NPCs, corrélée à la localisation au sein de ces structures de certains composants des NPCs.

Participation à des congrès scientifiques :
1. Molecular basis for membrane remodelling and organization (Jacques Monod conference, Roscoff, 2017) Poster
2. 7th GRISBI meeting « Biophysics, today and beyond » (mars 2018, Montpellier) Oral presentation

Une caractéristique des cellules eucaryotes est l'isolement physique du matériel génétique par l'enveloppe nucléaire (EN), une double bicouche lipidique composée de membranes nucléaires interne (MNI) et externe (MNE) séparées par un lumen appelé espace périnucléaire (PNS). Ancrés dans l’EN, les pores nucléaires (PNs) sont les seuls passages entre le noyau et le cytoplasme. Ils sont situés à des points de fusion entre les MNI et MNE.
En interphase, les cellules en prolifération dupliquent leurs matériel génétique, organelles, membranes et outils enzymatiques pour les répartir entre leurs cellules filles. La duplication des constituants cellulaires, à l’exception de l’ADN, est peu explorée. La réplication des PNs est un processus complexe combinant assemblage macromoléculaire et remodelage des membranes nucléaires. De plus, la barrière de perméabilité nucléaire doit être maintenue au cours de ce processus, soulignant l'étroite coordination entre assemblage protéique et fusion membranaire. L’assemblage de PNs en interphase nécessite la fusion locale des MNE et MNI. Ce processus doit impliquer le rapprochement des deux membranes, générant localement une combinaison complexe de courbures positive et négative dans les bicouches. Ceci est probablement suivi d’une étape d’hémifusion puis de fusion complète et d'ouverture d'un canal entre le noyau et le cytoplasme.
En règle générale, les déformations membranaires peuvent être induites par quatre mécanismes: (i) des forces mécaniques de traction sur les membranes; (ii) un modelage par des molécules présentant une surface cationique incurvée; (iii) une insertion hydrophobe dans un feuillet de la bicouche lipidique et (iv) l'encombrement stérique à la surface de la membrane, qui génère une pression latérale pouvant être atténuée par une augmentation de surface membranaire. D’après ce dernier modèle, un recrutement intensif de constituants des PNs en un site suffirait à induire localement une courbure membranaire. Notons que la plupart de ces mécanismes induisent des déformations convexes, c’est-à-dire une augmentation surfacique du feuillet membranaire en contact avec les agents de courbure. D’ailleurs, des protéines potentiellement impliquées dans la fusion des MNE et MNI induisent des déformations convexes sur des liposomes synthétiques. Pourtant, la déformation nécessaire à la formation des pores est concave. Cette divergence n’est pas comprise.
La méconnaissance des mécanismes moléculaires impliqués dans la déformation et la fusion des MNE et MNI tient à l’absence de marqueurs moléculaires des étapes précoces de ce processus. Jusqu'à présent, seule la microscopie électronique (EM) a permis d'évaluer l'existence et la topologie de ces intermédiaires. Cependant, les aspects dynamiques ne sont pas accessibles par EM.
La microscopie à force atomique (AFM) permet d’analyser la topographie de surface d’échantillons biologiques dans des conditions physiologiques, avec une résolution de l'ordre du nm. Nous proposons d’utiliser l'AFM pour analyser la topographie d’ENs et détecter la formation de creux dus au rapprochement des MNE et MNI. La combinaison AFM / microscopie de fluorescence super-résolutive permettra de corréler le recrutement de composants fluorescents avec la déformation des membranes nucléaires. Nous identifierons ainsi la séquence de recrutement des constituants des PNs et co-facteurs. Les candidats identifiés par ce biais seront appliqués à des ENs purifiées et la courbure membranaire résultante sera comparée à d'autres machineries de remodelage membranaire. Le rôle de pontages intra-PNS sera aussi étudié. Pour finir, les informations recueillies seront intégrées afin de déterminer la combinaison minimale de facteurs nécessaires pour induire la fusion de deux bicouches parallèles et le recrutement et l'assemblage de constituants des PNs dans des membranes ectopiques.

Coordinateur du projet

Madame Christine DOUCET (Centre de Biochimie Structurale)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

CBS Centre de Biochimie Structurale

Aide de l'ANR 259 342 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2016 - 48 Mois

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