Etude des mécanismes de la surdité à l'aide de la génétique intersectionnelle et l'analyse fonctionnelle chez la souris – DEAF

Cette étude concerne deux groupes de recherche avec deux expertises parfaitement complémentaires, la neurobiologie du développement et la neurophysiologie auditive. Grâce à cette synergie, nous utilisons une série de souris génétiquement modifiées pour cartographier et altérer fonctionnellement les sous-types neuronaux provenant de sous-domaines distincts du rhombomère 4 (r4) situé dans le tronc cérébral en développement. Ces outils nous permettront également d'utiliser des approches génomiques pour l'identification de nouveaux acteurs interactifs et moléculaires impliqués dans la mise en place de circuits auditifs spécifiques au r4. Nous combinons cette approche avec l'enregistrement de l’activité électrophysiologique qui se propage à parti du nerf auditif au cortex (ABR), l'électrocochographie et le patch clamp. Dans l'ensemble, nous combinons des approches génétiques, anatomiques et électrophysiologiques in vivo qui permettront de mieux comprendre comment les sous populations et les sous circuits du système auditif contribuent à la logique du codage du son et à la façon dont leurs altérations déterminent les différents types de surdité. De plus, notre stratégie intersectorielle génétique aidera à identifier les gènes candidats impliqués dans la spécification de différents sous circuits auditifs fonctionnels qui pourraient être utilisés dans le dépistage futur de mutations chez les patients atteints de perte auditive. Nous pensons profondément que notre étude peut contribuer à mieux comprendre les causes génétiques, développementales et anatomiques de différentes formes de perte auditive avec le but final de développer de nouvelles thérapies chez les patients.

Nous avons maintenant obtenu les différentes souches de souris transgéniques nécessaires à la stratégie génétique intersectorielle et à l'analyse fonctionnelle. Nous avons également validé l'activité de la ligne r4-Flippase en croisant les lignes b1r4Flpo et b1r4Cre avec le reporter lox/FRT et en évaluant que les cellules de r4 exprimaient correctement la GFP. Parallèlement, nous avons testé les lignes Cre de différents domaines dorso-ventral (DV) avec une souris reporter spécifique à la Cre, ce qui nous a aidés à caractériser tous les dérivées. Ensuite, les différentes lignes ont été croisées pour obtenir le génotype correct et nous permettre une cartographie détaillée des sous populations DV auditives spécifiques à r4. Nous suivons leur migration cellulaire et les projections axonales à différents stades et en utilisant des marqueurs spécifiques pour les sous-types neuronaux, comme prévu dans le projet.

En attendant le génotype correct des souris, nous avons finalisé la description complète de tous les dérivés de r4 en utilisant la ligne de souris r4-Cre croisée avec la lignée reporter YFP. Cela ne sera pas seulement très utile pour toute la communauté qui travaille sur le système auditif, mais elle représente également une base anatomique et cellulaire cruciale pour identifier les sous populations r4 spécifiques. Cette étude a été publiée dans le Journal Brain Structure and Function.

Notre partenaire étudie actuellement le rôle du faisceau olivo cochléaire de type cholinergique dans la cochlée en utilisant le modèle de souris Hoxb1null. Ils ont confirmé que les souris adultes Hoxb1null montrent un changement de seuil auditif, probablement en raison de la perte des cellules externes ciliées. En outre, ils ont démontré la perte d'innervation efférente cholinergique sur le développement des cellules internes chez la souris Hoxb1null. Ces données confirment bien nos premières données anatomiques et morphologiques, publiées précédemment.

Les types génétiques de surdité peuvent conduire à des formes non syndromiques ou syndromiques de surdité humaine. Par conséquent, l'analyse détaillée des déficits auditifs et l'identification des sous populations, des sous circuits et des gènes impliqués dans l'assemblage d'un système auditif normal sont une condition préalable pour envisager des futures thérapies.

La compréhension de la contribution des différentes structures et circuits neuronaux sur le processus de codage du son devient une priorité élevée pour une approche thérapeutique personnalisée. En raison de la grande complexité du système auditif, les études liées à la compréhension de la formation du système auditif ont été retardées par rapport à d'autres systèmes sensoriels. Nous sommes en train de disséquer le circuit auditif en sous circuits spécifiques et d'identifier les populations neuronales contribuant à ces circuits. En outre, nous prévoyons identifier les gènes impliqués dans différentes formes de surdité qui devraient favoriser le dépistage génétique et les traitements pharmacologiques pour les patients.

Enfin, il existe un grand intérêt de la part de la communauté scientifique à générer des lignées transgéniques spécifiques aux différents rhombomères. Ceci, principalement parce que l'origine et la fonction des sous populations distinctes du tronc cérébral sont mal comprises. Ainsi, les souris transgéniques produites dans le cadre de ce projet seront mises à la disposition de la communauté scientifique. Le coordinateur assistera à différents colloques scientifiques pour mettre à jour la communauté scientifique sur l'avancement du projet. Enfin, les résultats obtenus à partir de ce projet seront également publiés dans des revues de haut niveau pour atteindre un large public de biologistes, de neurophysiologistes et de cliniciens.

Publications:
1. Di Bonito, M., Boulland, J.L., Krezel W., Setti E., Studer, M.*, Glover, J.C.* Loss of projections, functional compensation and residual deficits in the mammalian vestibulospinal system of Hoxb1-deficient mice; eNeuro, 2015,Dec 26;2(6). doi: 10.1523/ENEURO.0096-15.2015.
2. Di Bonito M., Studer M., Puelles L. (2017) Nuclear derivatives and axonal projections originating from rhombomere 4 in the mouse hindbrain. Brain structure and functions.2017 May 3. doi: 10.1007/s00429-017-1416-0
3. Di Bonito M. and Studer M. (2017) Cellular and Molecular Underpinnings of Neuronal Assembly in the Central Auditory System during Mouse Development. Frontiers in Neuronal Circuits : 11 :18 doi :10.3389/fncir.2017.00018

Poster presentations:
1. Society of Neuroscience USA 2016. San Diego, CA, November 12-16, 2016. Di Bonito M., Setti E., Puelles L., Studer M. Anatomical, Molecular and Functional Characterization of Rhombomere 4-derived Sensorimotor Subcircuits.
2. 21st Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience, ISDN 2016, Antibes-Juan Les Pins, France May 11-14, 2016. Di Bonito M., Setti E., Studer M. Characterization of rhombomere 4-derived sensorimotor systems in the brainstem.

Le codage de l’information sonore est fortement tributaire de la mise en place au cours du développement de circuits neuronaux le long de la voie auditive. Ainsi, toute atteinte des structures auditives (périphérique ou centrale) est responsable de déficits auditifs. L’étiologie de ces derniers (génétique ou acquise), les structures affectées (sensorielles ou neuronales) et les manifestations cliniques (surdité légère à sévère, acouphènes, hypercaousie ou presbyacousie) empêchent le développement rapide de thérapies.

Dans cette proposition, nous envisageons de contribuer à l'identification et caractérisation de populations neuronales et de circuits impliqués dans le système auditif normal et pathologique en utilisant des approches génétiques, moléculaires, cellulaires et électrophysiologiques. Nous allons employer l'approche intersectionnelle génétique, qui grâce à la combinaison de lignées de souris Cre-loxP et Flp-FRT recombinases, permettra de tracer et analyser les populations et les circuits nécessaires à l'assemblage correct du système auditif. Nous allons croiser notre lignée r4-flippase récemment générée avec des souris Cre-recombinases spécifiques de populations neuronales sensorielles ou ventrales pour génétiquement identifier l'origine des sous-populations auditifs au sein de r4 et de les suivre dans le temps et l'espace.

Chez l’homme, la mutation du facteur de transcription HOXB1, exprimé dans le rhombomère r4 au cours de l’embryogenèse, est à l’origine d’une surdité. L’étude de la souris dont le gène Hoxb1 a été invalidé par recombinaison homologue montre une perte d’une partie des neurones auditifs afférents le long de la voie auditive ascendante. De plus, l’absence de Hoxb1 entraine une perte massive des faisceaux olivo-cochléaires efférents, qui proviennent du tronc cérébral et qui innervent l’épithélium neurosensoriel de l’organe de l’audition, la cochlée. La perte des faisceaux efférents est associée à la dégénérescence d’un contingent de cellules sensorielles auditives de la cochlée, les cellules ciliées externes.

Afin de déterminer plus en avant le rôle et la spécification des circuits auditifs afférent et efférent au cours du développement, nous proposons de construire les souris dont le gène Hoxb1 aura été invalidé dans les régions dorsale (sensorielle) et ventrale (motrice) du rhombomère r4, à l’aide d’outils de la génétique intersectionnelle. Ainsi, l’invalidation de Hoxb1 dans la région dorsale de r4 affectera préférentiellement la mise en place des neurones auditifs afférents dans les noyaux de la voie auditive. A l’inverse, la délétion de Hoxb1 dans la partie ventrale de r4 provoquera la perte spécifique des faisceaux olivo-cochléaires efférents. L’étude du phénotype de ces souris, à savoir la corrélation anatomo-fonctionnelle du système auditif, nous permettra donc de déterminer quelles sont les structures à l’origine de la surdité causée par la mutation du gène Hoxb1. De plus, l’invalidation de Hoxb1 dans les différentes régions du rhombomère r4 servira à identifier de nouveaux gènes impliqués dans la spécification des circuits neuronaux auditifs.

L’ensemble de ces résultats ne permettra pas seulement de comprendre les mécanismes à l’origine de la surdité liée à Hoxb1, mais aussi contribuera à notre compréhension des mécanismes impliqués dans les déficiences auditives dans les maladies humaines, et d'identifier de nouveaux gènes nécessaires dans l'assemblage du système auditif. Nul doute qu’une meilleure compréhension de ces mécanismes est un pré-requis indispensable pour les thérapies futures.