G-quadruplexes : structures et fonctions – G-QUAD

Construction de souches de levure porteuses de séquences potentiellement capables de former de G quadruplexes et test d'instabilité
Etablissement des structures RMN
Modifications et développement de nouveaux ligands; synthèse et analyses biophysiques par test de déplacement de fluorescence

Mise en évidence de l'instabilité des premières séquences G4 porteuses de boucles de taille variées
Structure RMN de G4 CEB25
Structure RMN d'un G4 avec le ligand PhenDC
Synthèse de dérivés des ligands existants

Poursuite les expériences engagées.
Préparer les méthodes de criblage à haut débit des mutants hélices de levure et de la collection de ligands.

Manuscrits prévus pour fin 2013

Les séquences d’ADN et d’ARN ont la capacité de former des structures G-quadruplexes (G4) correspondant à des empilements coplanaires de guanines stabilisés par des liaisons hydrogène Hoogsteen. Les G4 se forment par enroulement intramoléculaire de molécules simple brins contenant au quatre triplets de guanines séparées par quelques nucléotides. Il en résulte une large variété de conformations, dépendant de la taille et de la séquence des boucles. De nombreuses séquences susceptibles de former des G4 sont présentes dans les génomes mais les évidences de leur formation in vivo et la connaissance de leurs fonctions biologiques restent limitées. Nous avons récemment montré, chez la levure S. cerevisiae, que durant la réplication du brin continu, le minisatellite humain CEB1, capable de former des G4 est déstabilisé par le traitement des cellules par le PhenDC (un ligand des G4) et en l’absence de l’helicase Pif1. Ici, nous proposons de prendre avantage de ce nouveau système expérimental pour aborder les questions suivantes. Premièrement, déterminer le mécanisme moléculaire de cette instabilité dépendante de la réplication. Nous nous intéresserons à la formation d’ADN simple brin et déterminerons les protéines impliquées dans l’enroulementet la maturation de ces structures bloquantes. En particulier, nous examinerons le rôle des helicases et les polymérases translésionnelles. En second, nous nous intéresserons à l’effet mutagène des G4 et à leur rôle dans l’induction des réarrangements de génome, puisque celles sont souvent placées proche des points de translocation. En troisième, nous réaliserons une étude structure/fonction des G4 formés par les séquences hCEB1 et hCEB25. Pour cela, nous construirons et examineront l’effet sur l’instabilité d’une série diverse de mutations (substitution des guanines, changement de la taille des boucles, variation dans l’espacement des répétitions, séquences hybrides, etc…). Finalement, puisque les structures G4 diffèrent les unes des autres et pourraient donc être liées par des ligands différents, nous combinerons des approches de criblage in vitro et chemoinformatique d’une collection de composés affectant spécifiquement certaines séquences G4 d’intérêt thérapeutique (télomère, minisatellites et promoteurs d’oncogènes) et en parallèle nous criblerons leurs propriétés dans le système levure.