Application du PICh à la caractérisation du régulome de la transcription par l’ARN Polymérase III – PIChClassIII

Nous nous proposons de caractériser de manière exhaustive les protéines associées aux gènes transcrits par l’ARN polymerase III en adaptant la technique du PICh développée avec succès pour les régions très fortement répétée des télomères. Cette technique complexe peut être divisée en 4 étapes distinctes : préparation de chromatine, hybridation, purification, analyse par spectrométrie de masse. Dans un premier temps, un pontage chimique important est mis en œuvre en présence de formaldéhyde pour préserver les interactions protéines-ADN et protéines-protéines qui se déroulent dans la cellule. La préparation de la chromatine est ensuite réalisée par sonication, associée à des techniques enzymatiques de lyse d’ADN de manière à obtenir de larges quantités d’ADN soluble et de taille réduite. Dans une deuxième étape, la préparation de chromatine est hybridée avec des oligos comportant des acides nucléiques modifiés (LNA). Les conditions ont été largement optimisées par l’ajout d’additifs spécifiques. Concernant l’étape de purification, des comparaisons systématiques de billes magnétiques provenant de différents fournisseurs ont été réalisées et nous ont permis de définir celles qui correspondaient le mieux à nos désidératas (capacité, spécificité , prix d’achat). L’étape suivante consistera à réaliser des PICh à grande échelle (>20l de culture) avec la détermination du réseau de protéines associées aux gènes codant pour l’ARNr 5S par spectrométrie de masse. La comparaison de ces réseaux de protéines obtenus dans plusieurs conditions de croissance ou dans diverses espèces nous permettra d’identifier les facteurs stress et espèces spécifiques.

Nous avons adapté la technique, développée par notre partenaire pour capturer de manière spécifique les régions télomériques humaines, à la purification spécifique de l’ADN ribosomique 5S de la levure de boulanger et de cellules humaines.
Pour aboutir à ce résultat, diverses étapes de ce protocole complexe ont été optimisées.
Nous avons pu mettre au point la préparation d’une chromatine de levure parfaitement adaptée à notre projet après un pontage chimique fort, permettant de conserver les interactions protéines-protéines et protéines-ADN qui ont lieu in vivo. Nous avons également largement modifiée la préparation de la chromatine humaine. Nous avons aussi optimisé l’étape d’hybridation des oligos LNA sur l’ADN génomique en ajoutant divers additifs dans nos tampons d’hybridation.

La régulation de la transcription par l’ARN polymérase III joue un rôle majeur sur l’adaptation des cellules aux changements physiologiques ou aux variations de leur environnement. De même, le niveau des ARN synthétisés par la Pol III est anormalement élevé dans les cellules tumorales. L’aboutissement de ce projet va permettre de d’identifier de manière exhaustive les protéines capables de se lier aux gènes transcrits par l’ARN polymérase III. La caractérisation de ces protéines devraient permettre de dévoiler de nouvelles voies de régulation et donc de mieux comprendre les mécanismes de dérégulation. L’adaptation de cette technique à des gènes peu répétés voire unique lui conféra un intérêt général pour tous les scientifiques impliqués la biologie des génomes.

Présentation des résultats préliminaires obtenus au cours de congrès internationaux

Résumé web
Malgré les nombreux efforts réalisés depuis des décennies pour décrire au niveau moléculaire les divers processus nucléaires impliqués dans les transactions liées à l’ADN, les recherches n’ont que rarement pris en compte la complexité des processus existant au niveau d’un locus précis. C’est le cas par exemple des gènes de classe III, comme les gènes de l’ARN ribosomique 5S (ARNr 5S) et des ARN de transfert (ARNt), transcrits par l’ARN polymérase III (Pol III). À ce jour, tous les composants nécessaires à la transcription de base par la Pol III ont été identifiés chez la levure Saccharomyces cerevisiae. D’un autre côté, les voies de signalisation, qui régulent le niveau de transcription par la Pol III en réponse à des changements physiologiques ou bien encore lorsque les cellules sont cultivées en présence de divers stress, sont très peu étudiées. Il n’y a que très peu d’informations sur le déroulement de ces processus au sein de la chromatine et sur la manière dont les diverses voies métaboliques (modification et transport des ARN, réparation et réplication de l’ADN ) interagissent pour réguler la transcription. Pour obtenir une vue globale de l’ensemble des évènements qui ont lieu sur les gènes de classe III, il serait très important de caractériser tous les acteurs présents, c’est-à-dire liés.
Très récemment, une nouvelle approche protéomique appelée PICh (“Proteomic of isolated chromatin segment”) décrite par le partenaire 2 a permis d’identifier de manière exhaustive les protéines associées in vivo à l’ADN télomérique humain. Le but de notre projet est d’adapter la technique du PICh, basée sur l'hybridation de la chromatine avec une sonde modifiée d'ADN, à la chromatine de levure afin d’être capable d’identifier les protéines associées à divers gènes de classe III et de caractériser celles responsables de leur régulation transcriptionnelle. Dans un premier temps, il s’agira de mettre au point la méthode du PICh chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Comme les gènes codant pour l’ARNr 5S et les ARNt sont fortement occupés par la machinerie transcriptionnelle et qu’ils sont également présents en de nombreuses copies dans le génome, nous pensons que les gènes de classe III sont bien adaptés pour la technique du PICh. Le projet commencera par l’identification des protéines associées aux gènes codant l’ARNr 5S de levure. Il s'agira d'abord de développer des sondes capables de co-localiser avec la Pol III in vivo. Des expériences contrôles, réalisées pendant la mise au point du PICh sur les gènes d’ARNr 5S, devraient aider à définir la résolution de la technique, une autre limite possible de la méthode en particulier lorsqu’on travaille avec un organisme au génome compact comme la levure. Nous allons ensuite élargir cette étude à l’analyse des protéines associées aux gènes d’ARNr 5S de cellules humaines mais également à plusieurs gènes codant pour des ARNt dans les deux espèces. La comparaison des protéines associées à plusieurs gènes de classe III dans la levure et dans des cellules humaines devrait nous aider à identifier de nouveaux facteurs impliqués dans la transcription par la Pol III et à déterminer ceux qui sont conservés au cours de l’évolution. Pour identifier des facteurs de régulation stress-spécifiques, nous envisageons de réaliser le même type d’étude avec des cellules qui auront été préalablement traitées avec des drogues qui répriment la transcription par la Pol III : le 4NQO (un produit carcinogène qui mime l’exposition aux UV) ou la rapamycine (un agent chimique qui mime la limitation en nutriment). Pour valider l’ensemble de ce projet, nous déterminerons également le rôle de certaines de ces protéines dans la transcription par la Pol III et sa régulation, en utilisant des analyses classiques in vivo (approches génétiques, marquage métabolique in vivo) et in vitro (transcription in vitro, EMSA).