Blanc SVSE 5 - Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes : Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques

Etude des synthases de cyclodipeptides (CDPS), une nouvelle famille d'enzymes utilisant des ARNt aminoacylés pour former des liaisons peptidiques – CyDiPepS

Etude des synthases de cyclodipeptides (CDPS), une nouvelle famille d’enzymes utilisant des ARNt aminoacylés (aa-ARNt) pour former des liaisons peptidiques

Les CDPS constituent une nouvelle famille d’enzymes qui détournent des ARNt aminoacylés, molécules normalement dévolus à la synthèse protéique par le ribosome, pour les utiliser comme substrats et former les liaisons peptidiques de cyclodipeptides variés

Comment les CDPS fonctionnent-elles et quelle est la diversité des membres qui la composent ?

Les CDPS détournent les ARNt aminoacylés, des molécules dévolues à la synthèse protéique ribosomale, pour les utiliser comme substrats et ainsi catalyser la formation des liaisons peptidiques de différents cyclodipeptides. Ce sont des enzymes originales qui ne sont apparentées ni aux aminoacyl-ARNt protéine transférases et aux aminoacyl-transférases de type Fem qui utilisent également des ARNt aminoacylés comme substrats, ni à des synthétases non ribosomales de peptides (NRPS), la seule autre famille d’enzymes qui synthétise des cyclodipeptides. <br />Le projet consiste à comprendre les bases moléculaires de l’interaction des CDPS avec leurs substrats et à élucider le mécanisme que ces enzymes empruntent pour former des cyclodipeptides. Il a également pour objectif de caractériser les membres de la famille en terme de nombre, d’origine et de produits synthétisés. <br />Les retombées attendues de ce projet sont d’accroître nos connaissances fondamentales sur les CDPS, connaissances indispensables à acquérir avant d’envisager d’utiliser ces enzymes pour générer de nouvelles molécules biologiquement actives.

Une approche multidisciplinaire a été engagée. Elle a consisté à utiliser des méthodes classiques mais robustes de biologie moléculaire et de biochimie des protéines. La biologie structurale (cristallographie) a également été utilisée pour déterminer des structures de CDPS. Par ailleurs, la détermination des bases moléculaires des interactions des CDPS avec leurs substrats a pu bénéficier de la production d’ARNt aminoacylés et de leurs analogues par une méthode semi-synthétique faisant appel à la synthèse chimique des nucléotides.

Ce projet a clairement permis d’initier la compréhension du fonctionnement des CDPS en décrivant le mécanisme catalytique qu’elles empruntent et en identifiant des résidus impliqués dans l’interaction avec chacun des deux substrats. Il a également permis de mieux décrire la famille en mettant en évidence de nouveaux membres et en les caractérisant en terme de nombre, d’origine et de produits synthétisés.
L’acquisition de ces connaissances sur les CDPS permet d’envisager l’utilisation de ces enzymes pour générer de nouvelles molécules biologiquement actives.

Les retombées attendues de ce projet sont d’accroître nos connaissances fondamentales sur les CDPS, connaissances indispensables à acquérir avant d’envisager d’utiliser ces enzymes pour générer de nouvelles molécules biologiquement actives.

Le projet a permis de publier 5 articles et de produire des résultats qui seront également soumis à publication prochainement (2 à 3 articles). L’ensemble des résultats obtenus a permis de caractériser la famille des CDPS aux plans structural et mécanistique (Sauguet et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39, 4475) et de publier une revue (Belin et al. (2012) Nat. Prod. Rep. 29, 961-979). Le travail a aussi permis de préciser les interactions des CDPS avec leurs substrats (Santarem et al. (2014) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4, 3231 ; Moutiez et al. (2014) Nucl. Acids Res. 42, 7247) et de mettre en évidence de nouveaux membres de la famille des CDPS qui sont identifiés non seulement chez les bactéries mais aussi chez des eucaryotes (Seguin et al. (2011) Chem. Biol. 18, 1362). Par ailleurs, ce travail a permis d’élargir le répertoire des cyclodipeptides synthétisés par les CDPS (articles en préparation).

Les cyclodipeptide synthases (CDPS) constituent une nouvelle famille d’enzymes récemment mise en évidence par deux des partenaires du présent appel d’offre (Gondry et al., Nature Chem. Biol. 2009, 5, 414). Ces enzymes utilisent deux ARN de transfert aminoacylés (aa-ARNt) pour catalyser la formation de deux liaisons peptidiques et ainsi synthétiser un cyclodipeptide, structure qui forme le cœur de nombreux produits naturels doués d’activités biologiques intéressantes. Les CDPS sont des enzymes particulièrement originales qui ne sont apparentées ni aux synthétases non ribosomales de peptides (NRPS), la seule autre famille d’enzymes qui synthétise des cyclodipeptides, ni à aucune autre enzyme caractérisée fonctionnellement. Par ailleurs, les CDPS revêtent un intérêt notable du fait même des substrats qu’elles utilisent (Von Dohren, News and Views in Nature Chem Biol, 2009, 5, 374). En effet, les aa-ARNt sont des molécules essentiellement dévolues à la synthèse ribosomale des protéines et peu d’enzymes les utilisant comme substrats dans d’autres processus cellulaires sont décrites à ce jour. Parmi ces enzymes, les aminoacyl-ARNt protéine transférases et les aminoacyl transférases de type Fem, qui appartiennent à une même famille structurale (les protéines possédant un repliement GNAT), catalysent également la formation de liaisons peptidiques. Cependant, elles se distinguent des CDPS car elles n’utilisent qu’un seul aa-ARNt pour transférer l’acide aminé ainsi activé sur un peptide ou une protéine.

Dans ce contexte, notre projet consiste à déterminer comment fonctionnent les CDPSs, notamment à identifier les bases moléculaires de leur interaction avec des aa-ARNt et à élucider le mécanisme catalytique qu’elles empruntent pour former des liaisons peptidiques. Pour mener à bien cette étude, nous allons bénéficier de résultats que nous avons acquis récemment. Ainsi, le partenaire 1 de ce projet vient de résoudre la structure tridimensionnelle d’une des CDPS. Ces données structurales, outre le fait qu’elles nous permettent de confirmer l’originalité des CDPS car ces enzymes ne présentent pas un repliement de type GNAT, nous ont permis de mettre en évidence une similitude structurale entre les CDPS et une autre famille d’enzymes, qui du fait de son importance biologique, est très documentée dans la littérature. L’exploitation de cette similitude nous donne des atouts considérables pour atteindre nos objectifs. Par ailleurs, notre étude va également bénéficier du fait que nous allons pouvoir utiliser des approches expérimentales variées grâce à l’extrême complémentarité des quatre partenaires impliqués dans le projet. Ainsi, le partenaire 1 fera l’étude enzymologique des CDPS mais il prendra également en charge l’étude des interactions des enzymes et de leurs ligands, notamment grâce à ses compétences en biologie structurale. Ces études seront alimentées par le travail des partenaires 2 et 3 qui auront en charge la conception et la synthèse d’analogues d’aa-ARNt pertinents. Les compétences de ces partenaires qui sont habitués à travailler avec de telles molécules sont donc particulièrement précieuses pour l’avancée du projet. Quant au partenaire 4, il sera en charge de la recherche de nouveaux membres de la famille des CDPS et de la détermination des cyclodipeptides qu’elles produisent. Ces données permettront de mieux cerner les déterminants de la spécificité des CDPS et d’apporter des informations supplémentaires sur les résidus impliqués dans la catalyse. Le projet ainsi organisé permettra sans nul doute de caractériser et de documenter une nouvelle famille d’enzymes qui se révèle tout à fait originale.

Coordinateur du projet

Madame Muriel GONDRY (CEA - CENTRE D'ETUDES NUCLEAIRES SACLAY) – muriel.gondry@cea.fr

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

UPMC UNIVERSITE PARIS VI [PIERRE ET MARIE CURIE]
INSERM INSERM- DELEGATION PARIS VI
CNRS CNRS - DELEGATION REGIONALE ILE-DE-FRANCE SECTEUR SUD
UNIVERSITE DE PARIS DESCARTES CNRS-Laboratoire de chimie et de Biochimie, Pharmacologiques et Toxicologiques
CEA CEA - CENTRE D'ETUDES NUCLEAIRES SACLAY

Aide de l'ANR 529 839 euros
Début et durée du projet scientifique : - 36 Mois

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