Adaptation des Cellulases de T. reesei aux contraIntes de la Fermentation Ethanolique. – ACTIFE
Vers un procédé de production de bio-éthanol intégré et à coût réduit
L'intégration des étapes d'hydrolyse et de fermentation de la biomasse est porteuse d'économies potentielles pour le procédé de production de bioéthanol de 2ème génération, mais également de contraintes sur l'activité des enzymes. Ce projet se propose d'adapter certaines enzymes à tout ou partie de ces contraintes.
Réduire les coûts en enzymes et simplifier le schéma de production d'éthanol 2G
La mise en place d'une filière de production d'éthanol à partir de biomasse végétale non alimentaire (éthanol dit de seconde génération, ou 2G) est un enjeu important pour le secteur des transports. Dans ce procédé de production, la biomasse végétale prétraitée subit une hydrolyse par des enzymes produites par un champignon filamenteux, Trichoderma reesei. Celles-ci vont couper la cellulose en monomères de glucose. Ensuite, la levure de boulangerie Saccharomyces cerevisiae fermente ce glucose en éthanol.<br />L'étape d'hydrolyse enzymatique reste de loin la plus coûteuse du procédé, car une grande quantité d'enzymes doit être utilisée, notamment parce que le glucose inhibe l'action des enzymes. Un élément de solution possible est de réaliser la fermentation dans le même réacteur que l'hydrolyse afin que le glucose soit consommé au fur et à mesure de sa libération par les enzymes, mais les deux réactions requièrent des conditions opératoires différentes. Cela limite aujourd'hui les avantages de ce procédé de «SSF« (Simultaneous Saccharification and Fermentation). Le projet ACTIFE (Adaptation des Cellulases de Trichoderma reesei aux contraIntes de la Fermentation Ethanolique) vise à adapter les enzymes de T. reesei aux contraintes de la fermentation afin d'en diminuer les quantités à mettre en œuvre. L'objectif est de rendre le schéma de SSF avantageux par rapport au schéma classique comprenant des réactions séparées (SHF, Separate Hydrolysis and Fermentation).<br />
Le projet s'appuie en grande partie sur les technologies dites d'évolution dirigée. Ces technologies d'ingénierie génétique permettent de créer des «super-enzymes« adaptées aux conditions industrielles, et aux performances bien supérieures à celles des enzymes naturelles. Le principe est de créer des milliers de versions du gène codant pour l'enzyme d'origine, par mutation ou par recombinaison aléatoire de l'ADN, et de sélectionner les quelques-unes codant pour des enzymes ayant les propriétés recherchées. Cette dernière étape nécessite un criblage haut débit adapté (plusieurs dizaines de milliers de versions de l'enzyme criblées). Ces technologies miment les mécanismes de la sélection naturelle, mais l'accélèrent et l'adaptent aux besoins des procédés industriels.
ACTIFE fait également appel à des techniques de biochimie utilisées pour identifier, parmi le mélange d'enzymes produit par T. reesei, celles qui limitent l'hydrolyse dans les conditions de SSF. Ces enzymes limitantes sont améliorées par évolution dirigée puis réintroduites par génie génétique dans la souche d'origine ou la levure S. cerevisiae qui réalise la fermentation. L'efficacité des nouveaux mélanges et souches est évaluée en SSF et comparée à celle du mélange de base. Enfin, l'impact sur le coût de production de l'éthanol est évalué par simulation du procédé de production complet.
Au cours de la première année du projet, le rôle de chacune des enzymes principales du mélange d'enzymes de T. reesei en conditions de SSF a été étudié, permettant d'établir les cibles principales pour l'évolution dirigée. Cette technologie a également fait l'objet de développements spécifiques, et des verrous importants ont pu être levés au niveau des systèmes d'expression des enzymes et des méthodes de criblage haut débit de celles-ci. Des tests standards de SSF ont été mis au point et ont permis une première évaluation du procédé et la définition de cibles en termes de coût et de performance.
Plus de 10 versions d'enzymes adaptées à une température d'hydrolyse plus faible sont actuellement réintroduites dans le champignon T. reesei ou la levure S. cerevisiae. Quatre d'entre elles ont été exprimées avec succès et l'amélioration d'activité dans ces nouveaux hôtes a pu être confirmée dans plusieurs cas.
Les enzymes développées dans ce projet pourront être utilisées dans tout procédé de conversion directe de biomasse lignocellulosique en carburant ou produit chimique où les conditions de performances optimales du micro-organisme sont un obstacle à l'activité des enzymes.
Plus largement les cribles et méthodes développés pour les enzymes cellulolytiques pourront être employés à nouveau pour l'optimisation d'autres propriétés en fonction du procédé considéré.
Les méthodes de criblage d'enzymes et de détermination de leurs activités, stabilités et paramètres limitants pourront faire l'objet de publications et de présentations en congrès. Les enzymes améliorées seront brevetées. Actuellement, nous avons un brevet en cours de rédaction et un projet de publication. D'autres brevets sont possibles, en fonction des performances des nouvelles enzymes aujourd'hui en cours d'évaluation.
La production de bioéthanol à partir de biomasse lignocellulosique est l’un des axes majeurs du programme de l'ANR Bioénergies. L'hydrolyse enzymatique de la lignocellulose reste l'un des points fondamentaux à améliorer car cette étape clé du procédé représente une part importante du prix de revient de l'éthanol. Ce projet a pour ambition de développer un procédé économiquement viable de production d'éthanol à partir de ressources lignocellulosiques par Saccharification et Fermentation Simultanées (procédé SSF). Le programme envisagé consiste à i) adapter aux conditions d'hydrolyses spécifiques à la SSF les enzymes cellulolytiques majeures issues de Trichoderma reesei par évolution dirigée, ii) intégrer certaines de ces enzymes au sein de la souche de Saccharomyces cerevisiae réalisant la fermentation. L’objectif prioritaire est la diminution du coût du procédé par augmentation de la productivité globale de conversion cellulose-éthanol et diminution des charges en enzymes. Le projet est basé sur le développement d'enzymes adaptées aux contraintes spécifiques de la fermentation éthanolique (basse température, présence d'éthanol inhibant l'activité enzymatique etc.).
Coordination du projet
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Partenaire
Aide de l'ANR 0 euros
Début et durée du projet scientifique :
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