Validation de nouveaux partenaires de RHOB dans la signalisation MAPK/ERK dans le contexte des thérapies anti-EGFR – RHOBMAPK

Des études récentes menées dans l'équipe du Pr Gilles Favre au CRCT ont mis en évidence un rôle potentiel de la petite GTPase RHOB dans la résistance aux thérapies du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR). La surexpression de RHOB réduit la sensibilité des cellules à l'erlotinib de manière dose-dépendante et maintient la survie cellulaire. En outre, l'équipe a récemment identifié que l'activation de la voie de signalisation médiée par RHOB conduit à la résistance adaptative aux inhibiteurs tyrosine kinase de l’EGFR (EGFR-TKi). Le projet RHOBMAPK vise à étudier les mécanismes sous-jacents qui contrôlent cette réponse. En utilisant nos propres rapporteurs génétiques split-GFP, nous avons identifié de nouveaux partenaires d'interaction de RHOB dans la voie MAPK, notamment la kinase ERK, qui régule des processus cellulaires essentiels tels la prolifération et la différenciation des cellules. Nous avons également montré que RHOB régule négativement l'activité de cette voie en diminuant l'activité ERK et la viabilité cellulaire. Ce nouveau rôle de RHOB pourrait être essentiel dans la réponse aux EGFR-TKi, étant donné que la réactivation de ERK est une cause majeure de résistance.
Le projet a été divisé en trois parties et a été confié à quatre équipes de recherche spécialisées dans la signalisation des petites GTPases et le développement d'outils biotechnologiques (CRCT-INSERM, Toulouse), la protéomique (IPBS-CNRS, Toulouse), et la biophysique/biologie structurale (IPBS-CNRS et TBI, Toulouse). Notre premier objectif est de caractériser l'influence des modifications post-traductionnelles de RHOB sur les interactions avec ERK dans un modèle d'adénocarcinome bronchique PC9, et d'étudier la modulation de la formation de ces complexes lors du traitement par des EGFR-TKi tels que l'erlotinib et l'osimertinib. Nous examinerons l'impact de l'expression de RHOB sur l'homéostasie cellulaire à l’état basal et lors du traitement avec des inhibiteurs de ERK et de l’EGFR. Afin de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents, nous examinerons l'organisation supramoléculaire des complexes RHOB-ERK en utilisant une combinaison d'analyses protéomiques différentielles des complexes associés et des partenaires protéiques individuels. En outre, nous mènerons des études de perte de fonction sur les protéines qui sont spécifiquement liées aux complexes RHOB-ERK afin de mettre en évidence les régulateurs de ces complexes et d'identifier les phosphatases impliquées dans la déphosphorylation de ERK dépendante de RHOB. Notre deuxième objectif concerne l'analyse biochimique, biophysique et structurale des complexes RHOA-ERK et RHOB-ERK. Une analyse protéomique préliminaire a indiqué que les isoformes ERK1/2 peuvent interagir avec RHOB et son homologue RHOA, confirmant ainsi les résultats obtenus à l'aide de notre technologie split-GFP. Compte tenu de la disponibilité des assignations RMN antérieures de RHOA et ERK2 humaines, nous comparerons la structure de RHOA et RHOB dans leurs formes liées au GDP et au GTP, seules et en complexe avec ERK2. Nous identifierons les résidus clés potentiellement impliqués dans l'interface RHO-ERK2 et réaliserons l’ingénierie de mutants qui peuvent renforcer spécifiquement ces interactions pour des études structurales. En dernier objectif, nous utiliserons les informations biophysiques obtenues sur des mutants RHOB-ERK2 capables de déstabiliser leurs interactions pour explorer leur impact fonctionnel sur l'homéostasie et la signalisation cellulaire. Nous évaluerons l'impact de l’extinction des protéines régulatrices et des mutants déficients de l’interaction RHOB-ERK2 sur la réponse cellulaire aux EGFR-TKi des lignées cellulaires mutées pour l'EGFR. La réponse in vivo aux EGFR-TKI sera effectuée avec les candidats les plus prometteurs afin d'identifier les cibles pharmacologiques potentielles capables d'augmenter la sensibilité aux traitements.