Nouveaux Tags Fluorogéniques Photoactivables pour des Applications en Interactomique et Bioimagerie – OXO-Tags

La stratégie choisie pour le projet est la synthèse et criblage PCCF d’OXO-Tags 1ère génération par méthodes fluorimétriques, biochimiques et d’imagerie cellulaire, puis l’utilisation des OXO-Tags de 2nde génération obtenus en couplage avec des LOI pour valider l’interactome de ces LOI. Nos résultats expérimentaux préliminaires obtenus avec le carbonyldipyrrole comme modèle — incluant une photoactivation fluorogène bathochrome impliquant la formation de complexes covalents avec des protéines, la réversibilité de la photoactivation en l'absence de cible, l'imagerie fluorogène sur cellules vivantes et des applications en SDS-PAGE — constituent une solide preuve de principe (PoP) du concept OXO-Tag. Un criblage in silico*a permis d'écarter les OXO-Tags dont les propriétés prédites étaient sous-optimales et d'orienter la synthèse vers les candidats les plus pertinents. Sur la base de ces données préliminaires, nos principaux objectifs sont désormais les suivants : I – synthèse d'une sélection restreinte d'OXO-Tags issus du criblage in silico ; II – criblage fonctionnel de cette sélection selon les méthodologies établies pour la preuve de principe ; III – validation des OXO-Tags optimaux dans des modèles de référence — impliquant des ligands d'intérêt (LOI), petites molécules ou macromolécules, et leurs cibles ou partenaires connus — afin d'établir les OXO-Tags comme de nouveaux outils pour l'étude de l'interactome et l'imagerie ; IV – exploration et imagerie de l'interactome de nouveaux ligands d'intérêt pertinents à l'aide des OXO-Tags.

Le portfolio initial d’OXO-Tags de 1ère génération, conçu à partir de données in silico, modélisait les énergies de leurs états photoexcités et permettait de discriminer les molécules les plus aptes à photoalkyler une protéine cible. Ces OXO-Tags de 1ère génération étaient représentés sous forme de carbamates, prévus pour être de haute énergie – donc fortement photoalkykants – et pour être clivés post-irradiation. Le groupe carbamate prévu était de type Teoc (2-triméthylsilyléthylcarbonyle), susceptible d’être clivé en présence d’ions fluorures, choisis comme source d’activation rapide et peu cytotoxique donc compatible avec les systèmes cellulaires. Les OXO-Tags Teoc synthétisés, en absence d’irradiation mais présence de fluorure, relarguaient efficacement l’oxo-fluorophore de départ. Cependant, aucun d’entre eux n’a montré de photoadduit covalent fluorescent avec la BSA en SDS-PAGE, correspondant à notre 2nde preuve de principe. Nous avons raisonné que l’état excité très énergétique de ces OXO-tags carbamates pouvait être corrélé à un temps de demi-vie trop faible pour photoalkyler des molécules cibles. En comparaison, les oxo-fluorophores non-carbamates testés comme témoins montraient des adduits covalents avec la BSA, suggérant une meilleure balance réactivité vs. temps de demi-vie. Le portfolio revisité d’oxo-fluorophores comme OXO-Tags de première génération, sous forme de molécules de synthèse, correspondait aux squelettes chalcone, tetralone, xanthone, thioxanthone et acridone. Des réactions de substitution nucléophiles ont permis de fonctionnaliser les squelettes symétriques (xanthone, thioxanthone et acridone) sous forme bis-N-dialkyle (R, R’), en gardant R = méthyle et produisant des dérivés ou R’ était un alkyl-alcyne de longueur variable (3-6 carbones). L’études de ces dérives en spectrométrie-fluorimétrie et SDS-PAGE en présence de BSA comme cible modèle à permis de confirmer leur photoactivabilité sous excitation à large spectre (370-550 nm) et leur transition bathochrome post-photoalkylation, leur conférant un statut d’OXO-Tags de 2nde génération. Ces OXO-Tags ont été couplés par chimie clic avec des azides correspondants pour générer des dérivés de triphenylphosphonium (fonction ciblant la mitochondrie) et dérivés de peptide anti-oncogénique obtenu au laboratoire CITCOM, correspondant aux LOI retenus in fine pour le projet. Ces adduits sont en cours d’étude biologique (photalkylation à longueur d’one spécifique sur cellules Hela, localisation subcellulaire par imagerie de fluorescence, pull-down de cibles par couplage avec une biotine-azide en chimie clic pour identification de l’interactome).

Finalisation de l'étude biologique (i) de validation sur petite molécule (fonction triphénylphosphonium) avec imagerie mitochondriale de co-localisation (MitoTracker) et identification protéomique de protéines mitochondriales cibles; (ii) d'investigation de cibles tumorales sur fragment de protéine anti-oncogénique (fragment peptidique de haute affinité) par imagerie et identification protéomique des cibles.

En cours

Les petites molécules fluorescentes sont des outils indispensables dans la plupart des secteurs de la recherche biologique et biomédicale. En plus d’une fluorescence forte, brillante et stable, les fluorophores organiques doivent posséder des propriétés additionnelles pour répondre à des demandes en de plus en plus fortes. Parmi celles-ci, la photoactivabilité, la capture covalente et la fluorogenèse (abréviées par PCCF) constituent des caractéristiques très précieuses en chimie biologique moderne pour des applications en interactomique ou bioimagerie. Bien que l'intégration de la triade PCCF dans des motifs moléculaires uniques ("étiquette") soit très recherchée, cette association de propriétés est extrêmement rare et difficile à généraliser conceptuellement. A ce jour, seuls les azidoprofluorophores (APF), photoactivés en aminofluorophores bioincorporés, possèdent des propriétés PCCF générales. Les APF montrent cependant des limitations importantes, telles que photoactivation irréversible (avec destruction de l'étiquette en absence d'interactome biologique) ou difficulté à conjuguer chimiquement avec les entités d'intérêt étudiées. Nous proposons une modification unique des grandes catégories de colorants fluorescents couramment utilisés en recherche sous une forme appelée "OXO-Tags", leur conférant la triade PCCF désirée. Nous montrons par un grand nombre de preuves de principe préliminaires, expérimentales et in silico, que ces nouveaux tags possèdent de fait une intégration de propriétés PCCF. Ces tags initialement non-fluorescents peuvent ainsi être photoactivées et fournir des photoadduits fluorescents bioincorporés covalemment, démontrés en fluorimétrie, SDS-PAGE et imagerie cellulaire. Les OXO-Tags peuvent être facilement conjugués à diverses entités d'intérêt (ex : petites molécules bioactives, protéines, ARN) par utilisation d’espaceurs auto-immolables, offrant un contrôle de la photoréactivité du tag et capables de libérer post-photoactivation les deux composants séparément d'une manière programmée ("catch and release"). Ces étiquettes constitueraient des rapporteurs précieux pour l’identification des cibles de médicaments et produits naturels, les études interactomiques macromoléculaires, ainsi que l’imagerie cellulaire. Les objectifs de ce projet ANR sont de synthétiser, valider fonctionnellement puis biologiquement une génération optimisée d'OXO-Tags dans des paradigmes interactomiques de référence, mettant en jeu des associations connues, de type petite molécule (médicament)-cible et macromolécule (protéine ou ARN)-partenaire. Dans un second temps, les OXO-tags seront utilisés pour explorer les cibles et interactomes d'autres entités d'intérêt dans ces deux catégories moléculaires.