Ingénierie de métalloenzymes artificielles pour détoxifier des composés neurotoxiques organophosphorés – DetoxArtMet

Trois approches principales ont été explorées au cours du projet DETOXARTMET, combinant les expertises des 4 partenaires.

1. « Biohybrides » : Cette première approche repose sur la conception de métalloenzymes artificielles par greffage covalent de complexes organométalliques au sein d’une ossature protéique artificielle de type alphaRep, en combinant plusieurs variants protéiques, ligands chimiques et cations métalliques. La préparation de ces composés a conduit à l’obtention de plusieurs biohybrides associés à des ions métalliques bien caractérisés qui ont ensuite été testés sur des analogues d’OP et sur des OP réels. Similairement, une stratégie dite du « cheval de Troie », reposant sur l’association non covalente d’une protéine vectrice, la β-lactoglobuline, avec un complexe binucléaire de Cu(II) fonctionnalisé par une ancre d’acide laurique a également été explorée.

2. « Ingénierie d’enzymes » : La seconde approche reposant sur l’évolution dirigée d’une métallozenzyme humaine a permis d’identifier les verrous de cette approche. Un test de détection de l’activité d’hydrolyse de la liaison P-S a été mis au point à partir d'un analogue profluorescent d’agents V développé par le CARMEeN. Les positions diversifiables de l’enzyme ont également été explorées, et de nouvelles protéines chimériques ont pu être obtenues.

3. « Nanomatériaux » : Une troisième approche reposant sur des catalyseurs hybrides de type MOF (metal-organic framework) à base de zirconium, a permis d’obtenir des catalyseurs hydrolysant les OP comme le POX utilisé comme pesticide, mais également divers agents G utilisés comme armes chimiques.

Les approches proposées dans le projet DETOXARTMET ont permis d’obtenir de nouveaux catalyseurs pour la dégradation par hydrolyse ou oxydation de neurotoxiques organophosphorés. L’approche reposant sur la conception de métalloenzymes artificielles par greffage de covalent de complexes métalliques au sein d’une ossature protéique artificielle de type alphaRep a été explorée en combinant plusieurs variants protéiques, ligands chimiques et cations métalliques. La préparation de ces composés a conduit à l’obtention de plusieurs biohybrides associés à des ions métalliques bien caractérisés qui ont ensuite été testés sur des analogues d’OP et sur des OP réels. Les activités catalytiques observées n’ont pas atteint les performances escomptées.

La seconde approche reposant sur l’évolution dirigée d’une métallozenzyme humaine a permis d’identifier les verrous de cette approche. Un test de détection d’une activité d’hydrolyse a été mis au point à partir d’une nouvelle molécule mimétique d’OP fluorescente. Les positions diversifiables sur l’enzyme ont également été explorées et de nouvelles protéines chimériques ont pu être obtenues. Elles apportent de nouvelles connaissances sur l’ingénierie de métalloenzymes et ouvrent de nouvelles perspectives pour l’ingénierie d’enzymes pour des applications diverses.

Une troisième approche reposant sur des catalyseurs hybrides de type MOF (metal-organic framework) à base de zirconium a permis d’obtenir des catalyseurs d’hydrolyse d’OP neurotoxiques comme le POX utilisé comme pesticide, mais également de divers agents G utilisés comme armes chimiques. L’hydrolyse détectée est particulièrement rapide, de l'ordre de quelques minutes, dans des conditions physiologiques de pH. L’incorporation de ces catalyseurs dans des matériaux de type hydrogel a été initié et ce projet sera poursuivi dans le but de développer des patchs décontaminants pour une application cutanée.

Ce projet a donc permis d'explorer plusieurs approches intéressantes pour le développement de biocatalyseurs performants, au-delà de l’hydrolyse d’OP, afin de répondre à des besoins environnementaux et sanitaires. au travers des nouvelles collaboration initiées dans le projet DETOXARTMET, chaque partenaire a eu l’occasion d’explorer des approches au-delà des pistes initialement envisagées lors de la rédaction du projet. L’approche à base de MOF a conduit aux meilleurs résultats en termes d’activité catalytique et pourrait être poursuivie dans le cadre d'un nouveau projet ANR.

L'objectif de ce projet est de concevoir de nouvelles métalloenzymes artificielles pour la dégradation de neurotoxiques organophosphorés (OP) persistants. Des stratégies originales d'évolution dirigée seront développées pour trouver de nouvelles protéines permettant de réduire la toxicité de molécules OP choisies pour cibler des activités d'hydrolyse et/ou d'oxydation. Une première approche consistera à modifier par évolution dirigée les propriétés catalytiques d'une métalloenzyme humaine pour laquelle le métal est directement coordiné par la protéine. Sur la base d'une comparaison structurale, une banque de variants sera conçue et les activités catalytiques seront criblées par des tests innovants sur des molécules mimétiques d'OP modèles puis sur les agents toxiques réels. Une seconde approche consistera à générer des métalloenzymes hybrides par greffage covalent de complexes organométalliques synthétiques sur une architecture protéique. Une alphaRep issue d'une famille de protéines artificielles modulaires à motifs répétés sera choisie pour sa grande stabilité (pH, T, solvant).