Elucider la perception du Phosphate chez les plantes grâce au développement de l'imagerie en temps réelle de la transcription – ULTIM

Ce projet multidisciplinaire combine de très nombreuses approches:

- de génétiques avec la création de mutants multiples pour décomposer la redondance génétique des acteurs impliqués (PHR/PHL, SPX).

- de biologie moléculaire avec l’analyse de nombreux marqueurs de la carence en phosphate analysés par qPCR ou RNA seq.

- de biologie cellulaire avec le développement de nouveaux marqueurs fluorescent pour les plantes (protéines FAST et nouvelles générations de GFP) pour suivre en temps réel les différents acteurs impliqués et combiner ceci avec l’imagerie de la transcription (MS2/MCP) que nous avons mis au point il y a quelques années chez les plantes.

- de crible en levures (double hybride) pour identifier si les régulateurs étudiés pouvaient se trouver aussi impliquer dans d’autres régulations.

- de physiologie végétale pour analyser le phénotype des différents mutants générés.

 Nous avons amorcé un travail génétique de grande ampleur avec la création par l’approche CRISPR de mutants nuls (et leaky) pour les différents acteurs impliqués dans la régulation de l’homéostasie du phosphate. Nous avons produit différentes combinaisons entre ces mutants (double, triple et même quadruple). Certaines combinaisons s’avèrent létales confirmant l’importance de ces régulations (mais cet aléa a pu être contourné grâce à l’obtention d’allèles leaky).

 En biologie cellulaire nous avons adapté aux cellules végétales et démontré la fonctionnalité du système FAST (David et al., 2026, DOI 10.1111/tpj.70966) augmentant la palette de marqueur fluorescent, publié les protocoles détaillés de FISH (Hani et al., 2024, DOI 10.1007/978-1-0716-3766-1_6) et de transcriptomique en cellule unique (Hani et al., 2025, DOI 10.1007/978-1-0716-4248-1_4. En parallèle de nouvelles générations de protéines fluorescentes ont été testées en fusion avec la protéine MCP dans le domaine animal (équipe du Dr Bertrand) et transférées elles aussi chez les plantes (Publication en préparation). Les lignées transgéniques sont en cours de sélection et devrait faciliter les analyses de régulation de la transcription par leur résistance exceptionnelle au « bleaching » facilitant les analyses longues. L’ensemble de ces outils qui constituait une part importante de l’ANR sont donc réalisés et fonctionnels.

 Tous les gènes étudiés ont été clonés sous contrôle de leur propre promoteur et sous contrôle du promoteur 35S (pour s’affranchir des régulations transcriptomiques) en fusion avec des marqueurs fluorescent (décrits ci-dessus) et un TAG permettant des approches combinées de biochimie ou de biologie cellulaire. Les lignées transgéniques (dans background sauvage ou mutant pour vérifier la fonctionnalité des constructions) ont été produites (et sont en cours de sélection pour obtenir des lignées homozygotes).

 L’entreprise Hybrigenics a identifié grâce à plusieurs cribles de type « double hybride » de nombreux interacteurs confirmant la complexité du réseau d’interactions impliquant de nombreuses autres voies de régulation, qu’il convient de valider,

 L’entreprise BionomeeX a mis au point un programme de segmentation pour identifier les noyaux et les spots de transcription lorsqu’ils sont présents qui automatise le traitement des résultats obtenus avec la technologie MS2/MCP

Au final 6 publications ont été produites, 2 sont soumises et 3 autres sont en préparation. Les travaux ont fait l'objet de nombreuses conférences (en congrès internationaux) et séminaires (Universités ou Instituts). Le projet a permis une ouverture sur l'Europe avec l'obtention d'un projet européen pour continuer les travaux de biologie cellulaire initiés ici et à contribué à l'obtention de différents financements nationaux (ANR, sidaction...). Il a permis de former du personnel dans les différentes équipes (avec un recrutement en CDI à la clef chez BionomeeX).

-Ce projet a permis d’intégrer un « doctoral network Marie Curie » baptisé "Agile" financé par la communauté européenne, projet focalisé sur la biologie cellulaire du noyau chez les plantes. Une étudiante en thèse sera donc financée pour continuer le volet de biologie cellulaire de ce projet à partir de Septembre prochain.

-Il a permis l'obtentions de plusieurs publications et plusieurs vont suivre dans un proche à venir.

-De nombreux outils de biologie cellulaire FISH (Hani et al., 2024, DOI 10.1007/978-1-0716-3766-1_6), des (marqueurs fluorescents principalement protéines FAST (David et al., 2026, DOI 10.1111/tpj.70966), et de nouvelles GFP (publication en préparation) pour les plantes ont été produits, et mis à disposition de la communauté internationale.

-Sur la thématique de l'homéostasie du Pi une publication est en préparation sur les interactions entre le phosphate et les autres ions et une à deux autres devraient suivre pour exploiter tous les outils produits en vue de disséquer la contribution des régulations transcriptionnelles et post-transcriptionnelles impliquées. Ces publications devraient pouvoir être soumise dans des journaux majeurs (multidisciplinaires ou au top de ce qui se fait en biologie végétale) au vu des résultats novateurs obtenus.

Le contrôle de la transcription est essentiel pour l'adaptation des plantes aux fluctuations ambiantes. En mettant en œuvre un système d'imagerie ARN MS2 optimisé combiné à la microfluidique, nous avons obtenu des mesures quantitatives en temps réel et en live de l'activité transcriptionnelle de simples loci, dans toutes les cellules d'organes entiers d'Arabidopsis. Nous allons ici optimiser ce système en développant : (i)des technologies d'imagerie de l'ARN des cellules vivantes plus lumineuses et multicolores, basées sur l'amplification du signal grâce à des nanoparticules ; (ii)un nouveau logiciel pour automatiser l'analyse des centaines d'images produites. Ces outils seront combinés à la génétique pour disséquer le contrôle transcriptionnel complexe déclenché par un macronutriment végétal essentiel: le phosphate. Ceci permettra de répondre à de nombreuses questions fondamentales sur la réponse des cellules, connue pour être "bruitée " et hétérogène permet d'être intégrées et coordonnées au niveau d'un organisme. Les progrès apportés par ce projet offriront des outils et des concepts qui doivent contribuer à renouveler notre vision de la régulation de la transcription dépassant le cadre des plantes et bénéficier aussi aux métazoaires.