Dynamique et Topologie à l'échelle nanométrique du complexe Rab11-vRNP associé aux membranes dans des cellules infectées par le virus influenza – FluNanoTrack

Les virus influenza (IAV) représentent une menace grave et globale pour la santé publique. L’amélioration des mesures de prévention et de thérapie, qu'il s'agisse d’un vaccin universel ou de nouveaux médicaments antiviraux, reposera largement sur les recherches fondamentales visant à mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la réplication et la transmission virales. Dans le projet FluNanoTrack, nous nous focaliserons sur le complexe macromoléculaire résultant de l'association des ribonucléoprotéines virales avec la GTPase cellulaire Rab11.

Les ARN génomiques des virus influenza sont répliqués dans le noyau des cellules infectées sous la forme de ribonucléoprotéines virales (vRNP) et transportés vers la membrane plasmique. La GTPase cellulaire Rab11 se lie aux vRNP via une interaction directe avec la protéine PB2 (un constituant des vRNP) et participe au transport des vRNP. Cependant les mécanismes mis en jeu restent largement méconnus. Sur la base de nos travaux récents, nous émettons l'hypothèse que le transport des complexes Rab11-vRNP repose sur leur association physique avec le reticulum endoplasmique (RE) et des vésicules de transport Rab11-dépendantes, distinctes des endosomes de recyclage. L'objectif de FluNanoTrack est, en alliant les expertises complémentaires en virologie moléculaire, en imagerie biologique et en microscopie à haute résolution des trois partenaires, d’aboutir à une description mécanistique détaillée de la dynamique du complexe Rab11-vRNP et de sa topologie à l’échelle nanométrique, dans le contexte cellulaire.

Nous caractériserons l'interactome et la dynamique des complexes Rab11-vRNP dans des cellules vivantes infectées par un IAV. À cette fin, nous utiliserons i) un test de complémentation split-APEX2 permettant le marquage des facteurs cellulaires étroitement associés à un complexe protéine-protéine d'intérêt, combiné à de la spectrométrie de masse quantitative, et ii) la technologie SplitFAST développée par le partenaire 2, soit un test de complémentation par fluorescence permettant de visualiser en temps réel la formation et la dissociation de complexes protéiques dans des cellules vivantes. Des systèmes virus-cellules ad hoc seront mis au point en utilisant la génétique inverse pour produire des virus “PB2-taggé” et la technologie CRISPR-Cas9 pour produire des lignées de cellules “Rab11-taggée”. Un second objectif est de développer, à partir de la technologie SplitFAST, des méthodes innovantes pour l'imagerie des interactions protéine-protéine (IPP) à une résolution nanométrique, en microscopie optique à super-résolution ou en microscopie électronique (ME). D'une part, la luminosité et la photostabilité de SplitFAST seront optimisées pour une utilisation efficace en microscopie à déplétion par émission stimulée (STED). D'autre part, SplitFAST sera utilisé avec des chromophores ROSgéniques, afin de générer localement des ROS lors des IPP et de photoinduire la polymérisation de polymères osmiophiles pour la détection en EM. Enfin, les outils SplitFAST avancés qui en résulteront seront utilisés pour visualiser sans ambiguité à l'échelle nanométrique les complexes Rab11-vRNP dans les cellules infectées par un IAV. Nous les localiserons par rapport à des marqueurs du système endomembranaire et du cytosquelette en utilisant le STED, et par rapport aux ultrastructures cellulaires en utilisant la ME.

L'intégration de l’ensemble des données de protéomique, d'imagerie sur cellules vivantes et d'imagerie à haute résolution de FluNanoTrack devrait fournir une description mécanistique sans précédent des processus moléculaires impliqués dans le transport du génome ARN des IAV. En outre, les développements techniques proposés en microscopie STED et en EM auront un impact sur d'autres domaines d'études bien au-delà de la portée du projet proposé.