Thérapie génique dans des modèles murins et humain de dystrophies rétinienne ciblant les rétinopathies dominantes liées à CRX – CuRAT

Nous avons mis au point une approche de thérapie génique visant à introduire une copie fonctionnelle du gène CRX dans les photorécepteurs, les cellules sensibles à la lumière de la rétine. Pour cela, nous avons utilisé un vecteur appelé AAV, souvent utilisé en médecine pour livrer des gènes dans les cellules. Deux modèles expérimentaux ont été utilisés pour évaluer l’efficacité de cette thérapie :

o Étude chez les souris atteintes de maladies de la rétine liées à CRX

Nous avons injecté le vecteur AAV-CRX directement sous la rétine de deux types de souris malades. Pour cibler spécifiquement les photorécepteurs (cônes et bâtonnets), nous avons utilisé une séquence issue d’un gène normalement actif dans ces cellules. Les souris ont été traitées entre 1 et 2 mois d’âge et suivies pendant un an. Nous avons comparé les souris traitées avec celles ayant reçu un AAV de contrôle sans effet thérapeutique. L’effet de la thérapie a été analysé à l’aide de plusieurs tests : i) Observation de la rétine (microscopie) ii) Tests de la vision (électrorétinogramme, réflexe optomoteur, comportement visuel), iii) Analyses génétiques et protéiques pour vérifier la réactivation des gènes nécessaires à la vision.

o Étude sur des mini-rétines fabriquées à partir de cellules de patients

Nous avons créé des mini-rétines à partir de cellules souches dérivées de patients porteurs de mutations dans CRX : 2 atteints, 1 de l’ACL, 1 d’une maladie cône-bâtonnet (CORD) et 1 porteur asymptomatique. . Ces mini-rétines ont été traitées avec le vecteur AAV-CRX à différents moments de leur développement. L’efficacité du traitement a été évaluée par : i) microscopie en fluorescence, pour visualiser les cellules traitées, ii) analyses génétiques et biochimiques, pour vérifier l’activation des gènes de la vision, iii) microscopie électronique, pour observer la structure des cellules. L’ensemble des analyses a été réalisé a différents temps après le début de la différenciation des mini-rétine.

L’ensemble des méthodes utilisées a pour objectif de déterminer si notre produit de thérapie génique permet de restaurer l’expression des gènes essentiels à la vision et maintenir les photorécepteurs en vie, aussi bien dans des modèles animaux que dans des mini rétines issues de patients et produite en laboratoire.

o Étude chez la souris : des photorécepteurs réparés et une vision améliorée

Chez des souris atteintes de cécité précoce (modèle CrxRip/+), une seule injection sous la rétine de notre thérapie a permis de restaurer l'expression de marqueurs visuels clés, comme rhodopsine ou cone arrestin, et de reconstruire des photorécepteurs fonctionnels. Ces effets ont été observés jusqu’à 10 mois après le traitement, preuve d’un bénéfice à long terme. Des tests de vision (électrorétinogrammes et comportement en environnement éclairé) ont montré une amélioration de la perception visuelle, comparable à celle d’une souris non malade. Au niveau moléculaire, l’analyse du génome des cellules traitées a révélé la réactivation de gènes impliqués dans la vision, le développement des neurones et la protection cellulaire. Une prochaine étape consistera à affiner ces résultats cellule par cellule.

Un deuxième modèle transgénique, exprimant une forme mutée du gène humain CRX (CRXR41W) a permis d’observer que même en l’absence de dégénérescence visible, la thérapie pouvait corriger certains défauts d’expression des gènes.

o Étude sur mini-rétines humaines : efficacité variable selon la sévérité de la forme clinique

Nous avons généré des mini-rétines à partir de cellules de patients atteints de mutations CRX plus ou moins sévères. Les mini-rétines dérivés de patients souffrant de formes sévères (l’ACL) présentaient une forte réduction de l’expression des gènes visuels, confirmant un défaut majeur dans leur développement. À l’inverse, ceux issus de patients atteint de CORD ou asymptomatiques montraient des différences plus subtiles, démontrant que cette technologie est sensible même à des anomalies minimes.

Nous avons ensuite appliqué la thérapie génique à ces organoïdes :

Dans les cas les plus sévères, l’expression du gène CRX était restaurée, mais les autres gènes de la vision restaient peu exprimés.

Chez les organoïdes au phénotype modéré (CORD), la thérapie a permis une reprise d’expression de nombreux gènes essentiels à la vision, notamment ceux liés aux bâtonnets, aux cônes et à la perception lumineuse, ce qui reflète le rôle naturel de CRX dans le développement des photorécepteurs.

Cette étude démontre que la thérapie génique ciblant CRX peut restaurer les fonctions visuelles chez la souris et corriger partiellement les défauts génétiques dans des mini rétines humaines dérivés de patients. Notre produit de thérapie génique offre donc un espoir de traitement pour certaines formes héréditaires de cécité, en particulier lorsque les lésions ne sont pas encore trop avancées.

Les résultats prometteurs obtenus grâce au soutien de l'Agence Nationale de la Recherche (ANR) sur notre thérapie génique ciblant les maladies rares de la rétine liées au gène CRX ont attiré l’attention de la Pr Francesca Simonelli, une spécialiste de renommée mondiale basée à Naples (Italie). Elle a spontanément pris contact avec notre équipe pour préparer un essai clinique chez les patients CRX. Elle mène déjà une étude de suivi chez ces patients afin de bien caractériser la maladie et sa progression dans le but de permettre leur éventuelle inclusion pour un futur essai clinique.

Grâce à nos travaux soutenant la pertinence d’un projet d’essai clinique, nous projetons de produire le vecteur viral AAV-CRX selon les normes cliniques (GMP), et de tester son innocuité, une étape indispensable avant les essais cliniques. Une biotech française Variant participe également au développement du produit.

Notre projet s’est enrichi de nouvelles collaborations avec le Dr Diego Di Bernardo (TIGEM, Italie) et le Pr Roman Jerala (Institut Chimique, Slovénie), afin de développer et tester in vivo des "circuits génétiques intelligents" permettant de contrôler avec précision l’expression du gène thérapeutique dans les cellules. Le gène CRX est particulièrement sensible à la dose : il faut en produire suffisamment pour activer la différenciation des photorécepteurs, mais sans excès, au risque d’une potentielle toxicité. Notre vecteur AAV-CRX est donc un excellent candidat pour tester cette technologie de régulation fine.

Nos données génétiques (RNA-Seq) et notre connaissance du rôle central de CRX nous ont amenés à proposer une nouvelle hypothèse : la thérapie AAV-CRX pourrait par ailleurs être bénéfique dans d’autres maladies de la rétine non directement causées par CRX. Nous avons déjà montré un effet neuroprotecteur du traitement chez une souris modèle de rétinite pigmentaire. De nouveaux tests sont en cours pour vérifier cette efficacité dans d’autres modèles.

Enfin, nos analyses sur les mini-rétines humaines créées à partir de patients ont révélé une observation surprenante : chez un patient porteur d’une mutation CRX mais ne présentant aucun symptôme, nous avons détecté des niveaux d’expression différents entre l’allèle sain et l’allèle mutant. Ces résultats suggèrent que ce patient pourrait bénéficier d’un mécanisme de compensation naturel encore mal compris. Nous allons approfondir cette piste, car elle pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir ou retarder l’apparition des symptômes.

Grâce à une recherche fondamentale solide, des partenariats internationaux et un fort soutien institutionnel, la thérapie génique CRX s’apprête à franchir une étape cruciale : l’essai clinique chez l’humain. En parallèle, nos travaux ouvrent de nouvelles perspectives thérapeutiques pour d’autres maladies de la rétine, et peut-être même pour anticiper la maladie chez des patients encore asymptomatiques.

Les dystrophies rétiniennes héréditaires (DRH) sont hétérogènes sur le plan génétique et clinique. Malgré les énormes progrès encourageants de la recherche au cours des dernières années, ces maladies entraînent toujours une cécité légale en raison du nombre limité d’options thérapeutiques. Le succès récent de supplémentation génique chez les patients atteints d’amaurose congénitale de Leber (ACL) causée par des mutations RPE65 a montré le réel intérêt pour étendre cette approche à d’autres DRH. Nos travaux antérieurs suggèrent que les mutations dominantes liées à CRX, un facteur de transcription essentiel au développement et à la maturation des photorécepteurs, représentent des candidats pertinents pour la thérapie génique. À ce jour, plus de 50 mutations du gène CRX sont responsables des dystrophies à cône-bâtonnet (CORD), de l'ACL et de la rétinite pigmentaire (RP).
En raison de l'hétérogénéité clinique des patients porteurs de mutations dans le gène CRX, notre projet vise à restaurer et/ou maintenir la vision dans deux modèles murins de rétinopathies associées à CRX : un modèle d’ACL que nous avons déjà bien caractérisé et un nouveau modèle de CORD. Dans ce contexte, nous évaluerons si notre approche de thérapie génique est capable de compenser les effets délétères des mutants CRX dans ces deux formes. Par conséquent, un vecteur AAV exprimant CRX sera administré, et son efficacité à long terme sera évaluée, dans les deux modèles. Après l'administration du vecteur, la récupération et/ou la préservation de la fonction rétinienne seront testées par des réponses d’électrorétinogramme et de réflexe optocinétique, et la morphologie rétinienne par tomographie par cohérence optique. L'étude sur l'efficacité et la toxicité sera complétée par des analyses histologiques et moléculaires. Afin de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et de valider l'approche thérapeutique chez l'homme, nous utiliserons également des organoïdes rétiniens dérivés d'iPSC de trois patients porteurs de différentes mutations dans CRX et atteint de LCA, CORD ou RP. En analysant l'expression différentielle des gènes et des protéines, ainsi que la morphologie des organoïdes tout au long de la différenciation et de la maturation de la rétine, nous établirons une corrélation génotype-phénotype et, par conséquent, nous éluciderons les bases des profils cliniques différentiels associés à chaque mutation. De plus, nous obtiendrons des données pertinentes pour tester l'efficacité d’une supplémentation génique par vecteur AAV après transduction des organoïdes de patient. De cette façon, nous déterminerons si toutes les formes peuvent bénéficier de notre approche thérapeutique, sans effets négatifs liés à la surexpression du CRX.
Au terme de cette étude préclinique, nous aurons démontré l'efficacité de notre thérapie génique chez des modèles murins et humains présentant des mutations dominantes de CRX. La valeur clinique potentielle de ce projet réside dans le développement d’une thérapie génique traitant un large spectre de rétinopathies associées à CRX et pourrait servir de preuve de concept pour les autres DRH dominantes. Cette étude pourrait servir de base à la poursuite du développement d’essais cliniques.