Contrôle de la fonction mitochondriale par un mécanisme d'endocytose Rab4b-dependant – EndoMitR

Nous avons utilisé diverses sondes fluorescentes en cytométrie spectrale en flux pour évaluer les fonctions mitochondriales, RNAseq pour identifier les gènes dépendants de Rab4b, la microscopie électronique pour caractériser les différences dans les endosomes et les mitochondries. Nous avons développé un modèle de souris pour purifier les mitochondries de T exprimant ou non Rab4b pour la protéomique et la métabolomique. Nous avons établi un modèle KI de souris pour ajouter une étiquette à l'extrémité N-terminale de Rab4b afin d'étudier par super résolution et microscopie électronique la localisation de Rab4b endogène concernant les endosomes et les mitochondries dans les cellules primaires.

Nous avons montré que le knock-out de Rab4b dans les cellules T CD4⁺ naïves réduit le potentiel de membrane et la respiration mitochondriale, ce qui entraine une diminution de la production d'ATP. Cependant, cela ne s'accompagne pas de changements dans le nombre de mitochondries, leur morphologie ou le contenu en complexes OXPHOS. En outre, l'apoptose, le stress oxydatif et la mitophagie ne sont pas affectés. Nous confirmons que Rab4b régule le recyclage du récepteur de la transferrine, une protéine clé pour l'activation et la différenciation des cellules T, en raison de son rôle dans l'approvisionnement des mitochondries en fer ferrique, un cofacteur pour les complexes de la chaîne respiratoire. Nous avons également démontré que la teneur en fer des mitochondries est réduite dans les cellules T déficientes en Rab4b, bien que l'absorption et le trafic du fer dans les endosomes ne soient pas altérés. En utilisant la microscopie électronique à balayage en série, nous avons révélé que les endosomes établissent des sites de contact avec les mitochondries dans les cellules T naïves. De plus, nous montrons que Rab4b est détecté à proximité des mitochondries dans les cellules T naïves et que les endosomes marque s par Rab4b et contenant de la transferrine internalisée interagissent dynamiquement avec les mitochondries dans les cellules HeLa. Rab4b pourrait donc participer a la formation de sites de contact entre la

mitochondrie et l’endosome pour permettre le transfert du fer entre les deux organelles. Ces résultats mettent en évidence un nouveau rôle de Rab4b dans le lien entre le recyclage endosomal et la fonction mitochondriale, avec des implications potentielles pour le métabolisme et la différenciation des cellules T.

Nous avons également montré que Rab4b, précédemment identifié comme un régulateur du trafic entre les endosomes précoces et les endosomes de recyclage, joue également un rôle dans le trafic entre les endosomes et le réseau trans golgien (TGN). Plus précisément, la surexpression de Rab4b, sauvage ou actif, augmente le transport rétrograde du récepteur du mannose-6-phosphate indépendant des cations (CI-M6PR) vers le TGN, alors que la désactivation de Rab4b ou la surexpression de sa forme inactive entrave ce processus. Cette régulation passe par l'interaction de Rab4b actif avec VPS52, une sous-unité du complexe GARP (Golgi-associated retrograde protein). Nous avons démontré que la déplétion de Rab4b empêche le CI-M6PR internalisé d'atteindre les structures marquées par VPS52, ce qui le piège dans les endosomes précoces et l'empêche d'accéder au TGN. Ces résultats établissent que Rab4b est un régulateur du trafic rétrograde endosome-TGN, agissant par l'intermeéiaire du complexe GARP pour faciliter le tri des protéines vers le TGN.

Notre projet est un projet de recherche fondamentale en biologie cellulaire dans le sous-domaine de l'interaction inter-organite pour l'homéostasie cellulaire. Il devrait apporter de nouvelles connaissances fondamentales sur le rôle de l'endocytose pour le contrôle des fonctions mitochondriales. L'originalité dans le domaine est d'étudier une cellule primaire dans des contextes physiologiques alors que le plus souvent, les études dans ce domaine utilisent des lignées cellulaires cancéreuses de laboratoire qui ont un métabolisme anormal. Nous obtiendrons ainsi des résultats sans facteurs de confusion liés à des processus non physiologiques. Les cellules primaires étudiées étant des lymphocytes T, nos travaux pourraient avoir un impact dans les domaines de l'immunologie et/ou de l'immuno-métabolisme.

Nous continuerons à explorer le rôle de Rab4b dans le contrôle des fonctions des tissus métaboliques dysfonctionnels dans un contexte d'obésité. Une étude dans le foie est en cours de publication et les souris KI SNAP-Rab4b générées grâce à ce financement ont permis de répondre à une question des reviewers. Le développement de cette souche de souris exprimant de manière endogène SNAP-Rab4b offrira de nombreuses opportunités pour répondre à des questions supplémentaires en biologie cellulaire et en pathologies.

Les souris MITO-Tag_Rab4bfl/fl peuvent être un outil pour des études dans d'autres domaines. En particulier, nous prévoyons de les partager avec des équipes travaillant en neurosciences car Rab4b est fortement exprimé dans le cerveau, il interagit avec le complexe GARP qui est muté dans un modèle murin de sclérose latérale amyotrophique et a été impliqué dans des troubles dépressifs majeurs.

N/A

Les mitochondries, fournisseur d'énergie des cellules eucaryotes, doivent adapter leurs fonctions à l'environnement, mais les mécanismes impliqués ne sont que partiellement connus. Comme l'endocytose est un processus clé pour informer la cellule sur son environnement, nous faisons l'hypothèse que des régulateurs du trafic endosomal sont impliqués dans l'homéostasie mitochondriale. Nos travaux préliminaires indiquent que la GTPase Rab4b, une Rab endosomale impliquée dans le tri à partir des endosomes précoces, est un bon candidat pour cette fonction. En effet, nous avons montré que dans les lymphocytes T, cellules pour lesquelles la plasticité mitochondriale est cruciale pour adapter leur fonction à l’environnement, la protéine Rab4b est cruciale pour leur différenciation et est nécessaire à la respiration mitochondriale. De façon importante, l’absence de Rab4b ne mime pas les effets de l’absence d’autres Rabs endosomales sur les mitochondries. Les objectifs du projet EndoMitR sont donc 1) de caractériser les défauts mitochondriaux dans les cellules déficientes en Rab4b 2) d’identifier les processus dépendants de Rab4b qui contrôlent les mitochondries. Pour répondre à ces objectifs, nous avons établi une lignée de souris pour augmenter la fiabilité et l’efficacité des études sur les mitochondries dans les cellules T et construit le projet EndoMitR basée à la fois sur des expériences dérivées d’hypothèses et des études sans a priori. Ce projet rassemble des experts de la biologie cellulaire des processus d’endocytose et de la fonction mitochondriale et de l'imagerie multi-échelles des organelles cellulaires. Il permettra de générer de nouvelles lignées de souris et des données de omics qui seront partagées avec la communité scientifique. Le projet EndoMitR devrait apporter de nouvelles connaissances fondamentales sur le rôle de l'endocytose dans le contrôle des fonctions mitochondriales avec des répercussions dans les domaines de l'immunologie et / ou de l'immuno-métabolisme.