Origines du Système Endomembranaire chez les Eucaryotes: la Fonction de la Famille des GTPases Arf est-elle Apparue chez les Archaea? – ArchaeArf

Analyses phylogénétiques

Les séquences métagénomiques et génomiques destinées à l'analyse ont été explorées à l'aide de logiciels bioinformatiques, en utilisant des requêtes appropriées pour identifier les séquences d'intérêt. Les séquences candidates de GTPases ont été validées et les protéines n'appartenant manifestement pas à la superfamille Ras ont été éliminées. Les GTPases putatives de la superfamille Ras ont été systématiquement identifiées dans un ensemble de 62 assemblages de génomes d'asgardarchaeotes de référence.

Des analyses phylogénétiques ont été réalisées pour différentes combinaisons de séquences afin de les annoter et de définir leurs relations phylogénétiques. Des alignements de séquences ont été construits à l'aide d'un logiciel approprié, les alignements ont été rognés et les arbres ont été déduits à l'aide de la méthode du maximum de vraisemblance (ML) implémentée dans le programme bioinformatique IQ-TREE.

Approches de biologie moléculaire et cellulaire

Nous avons exprimé des gènes codant pour les protéines ArfR d'archées Asgard dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Des gènes synthétiques codant pour les protéines HodArfR1 et GerdArfR1 d'archées Asgard, optimisés pour l'expression dans la levure, ont été clonés dans un vecteur d'expression de levure. Les mutants ont été obtenus soit par mutagénèse dirigée, soit par synthèse de gènes. Les souches de levure transformées avec des plasmides d'expression ont été cultivées jusqu'à la phase logarithmique moyenne dans un milieu sélectif, puis imagées. Les images ont été acquises à température ambiante à l'aide d'un microscope confocal à disque rotatif CSU-W1 (Yokogawa - Andor) piloté par les logiciels MetaMorph ou ZEN 2. Le rapport membrane/cytosol a été calculé en divisant la valeur de fluorescence membranaire par la valeur moyenne de fluorescence cytosolique. Au moins trois expériences indépendantes ont été réalisées pour chaque transformant.

Cristallographie aux rayons X et méthodes biophysiques

Les ADNc optimisés d'Escherichia coli codant pour HodArfR1-FL-WT, HodArfR1-Δ14-Q72L, GerdArfR1-FL-WT et GerdArfR1-Δ12-Q69L ont été obtenus par synthèse génique. Chaque insert a été sous-cloné dans le plasmide pET21a et produit dans E. coli BL21 DE3 sous forme de protéine de fusion avec un tag His6 C-terminal non clivable, puis purifié.

Pour les essais de cristallisation avec la forme des protéines ArfR liée au GDP, l'échange de nucléotides a été réalisé à partir de protéines purifiées incubées dans 2,5 mM d'EDTA pendant 5 minutes à température ambiante, en présence d'un excès molaire 10x de GDP (5 mM de GDP). L'échange a été arrêté par l'ajout de 5 mM de MgCl₂ et l'excès de nucléotide a été éliminé par dialyse. La cristallisation, la collecte des données et les statistiques de raffinement, ainsi que la détermination de la structure et le raffinement ont été réalisés.

Nous avons découvert un nouveau groupe de GTPases archéennes, les protéines apparentées à Arf ou ArfR, dont le lien évolutif direct avec les GTPases de la famille Arf des eucaryotes a été solidement étayé par nos analyses. Les GTPases ArfR ont très probablement évolué chez l'ancêtre commun des Asgardarchaeota et, fait remarquable, on les retrouve dans les lignées les plus proches des eucaryotes, les Heimdallarchaeia. Ainsi, le groupe ArfR est clairement à l'origine des GTPases de la famille Arf eucaryotes.

Au moment où nous avons mené nos études, aucun organisme des Heimdallarchaeia n’avait été cultivé, il était donc impossible d’étudier la localisation des ArfR dans leur contexte cellulaire natif. Nous avons donc procédé à une expression hétérologue chez Saccharomyces cerevisiae. Afin de déterminer si ces protéines ont la capacité de se lier aux membranes cellulaires, des gènes synthétiques codant pour deux protéines ArfR d’Asgard ont été exprimés chez la levure sous forme de fusions GFP, puis observés par microscopie confocale. Nos résultats ont indiqué que la liaison membranaire dépend entièrement de l'hélice amphipathique (AH) N-terminale et que la liaison au nucléotide guanine régule l'association membranaire réversible. Nous avons ensuite exprimé ces GTPases ArfR d'Asgardarchaota dans E. coli, puis les avons purifiées. Nous avons déterminé les structures cristallines des formes liées au GTP et au GDP de chacune d'entre elles. Nos études structurales ont montré que ces deux GTPases ArfR, et probablement d'autres protéines ArfR des asgardarchaeotes, partagent avec les protéines de la famille Arf eucaryotes le mécanisme de basculement entre les états qui déloge le domaine AH N-terminal, ce qui constitue le fondement de la régulation de la localisation cytosolique-membranaire de ces protéines.

Nous avons réussi à reconstituer l'ancêtre des protéines Arf1 et Arf6, toutes deux présentes chez le dernier ancêtre commun des eucaryotes (LECA). Cette étude étend la portée de cette approche de reconstitution aux protéines antérieures au LECA et a fourni de nouvelles informations sur cet ancêtre commun de deux protéines de la famille Arf. De plus, cette étude a révélé des propriétés inattendues des protéines Arf1 existantes chez tous les eucaryotes.

Nous avons réalisé une analyse phylogénétique du complexe CSW, protéine activatrice de la GTPase Arf, et avons découvert qu'il est ancien, les trois sous-unités étant présentes chez le LECA. De plus, nous avons pu identifier des homologues de la sous-unité catalytique du CSW chez les Asgardarchaeota.

L'un des événements les plus importants de l'évolution de la vie a été l'émergence des eucaryotes à partir de leurs ancêtres procaryotes. Un membre de notre équipe initiale (P4) a fait la découverte passionnante de ce qui semble être la lignée tant recherchée dont sont issus les eucaryotes : les archées d'Asgard. Cette découverte a offert une occasion sans précédent de comprendre comment les eucaryotes ont évolué. Nous avons démontré dans ce projet qu'une famille clé de régulateurs du trafic membranaire, les GTPases de la famille Arf, est apparue chez les archées d'Asgard, avant l'acquisition des mitochondries. Nos résultats suggèrent que ces protéines pourraient avoir joué un rôle dans l'émergence du système endomembranaire chez les eucaryotes, mais cela reste encore à établir.

Notre projet a ouvert plusieurs nouvelles pistes dans les domaines de l'eucaryogenèse et du trafic membranaire chez les eucaryotes. Tout d'abord, nous avons déjà identifié des régulateurs et des effecteurs potentiels des protéines ArfR chez les archées d'Asgard. Sur la base des homologies avec les protéines eucaryotes, nous avons sélectionné les partenaires d'interaction potentiels les plus pertinents et les plus intéressants, et nous poursuivons la validation expérimentale des interactions et des effets sur l'activité des GTPases ArfR.

Les résultats obtenus dans le cadre de ce projet ANR ont montré que des homologues du complexe C9orf72–SMCR8–WDR41 (CSW) sont présents chez tous les eucaryotes et existaient probablement déjà chez le dernier ancêtre commun des eucaryotes. Ce résultat est significatif, car les sous-unités catalytiques du CSW interagissent avec les protéines Arf par l’intermédiaire de leurs domaines Longin, un repliement protéique ancien déjà présent chez les archées d'Asgard. En effet, nous avons découvert que les sous-unités C9orf72 et SMCR8, toutes deux nécessaires à l'activité catalytique, ont des homologues chez les Asgardarchaeota. Il a été démontré que le complexe CSW humain possède une activité élevée en tant que protéine activatrice de GTPase (GAP) pour Arf1, Arf5 et Arf6 in vitro, et une possibilité intéressante est que certaines des sous-unités du CSW présentes chez les archées d'Asgard soient des GAP pour les ArfR. Nous avons commencé à explorer cette possibilité.

La fonction GAP de CSW vis-à-vis des Arf n'a pas été étudiée dans un contexte physiologique, mais uniquement in vitro. Nous avons commencé à aborder cette question dans des cellules mammifères en culture, utilisons des techniques de co-immunoprécipitation et de colocalisation. La sous-unité C9orf72 de CSW a été impliquée dans des maladies neurodégénératives, notamment sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la démence frontotemporale (DFT). Cependant, la fonction moléculaire du gène C9orf72 reste encore méconnue. Il est possible que notre nouvelle perspective évolutive apporte un éclairage sur cette question.

Cette proposition vise à aborder les origines et l'évolution cellulaire profonde de la famille Arf de petites protéines G (Arf_F), fournissant de nouvelles informations sur l'eucaryogenèse, avec des implications importantes pour l'organisation cellulaire eucaryote. Les protéines eucaryotes Arf (Arf_E, composée des protéines Arf, Arl et Sar) sont des régulateurs essentiels de la structure et de la fonction du système endomembranaire, caractéristique des cellules eucaryotes. Une découverte récente et très intéressante est l’existence de protéines apparentées à Arf dans les lignées d’archées récemment découvertes (les archées Asgard), ce qui suggère que ces protéines étaient présentes dans l’ancêtre commun des archaea et des eucaryotes. Nous allons combiner les approches bioinformatique, biologique cellulaire, biochimique et structurelle pour tester l'hypothèse selon laquelle ces protéines prédites sont des GTPases Arf véritables. Pour atteindre cet objectif, nous allons tester si ces protéines prédites possèdent les aspects biochimiques caractéristiques des GTPases Arf_E qui permettent leur fonction. Les petites GTPases liées aux Arfs font partie des très rares composants de trafic membranaire présents chez les archées d’Asgard. L’existence des GTPases Arfs dans les archées suggère qu'elles constituent l'une des composants clés impliquées dans l'eucaryogenèse.