Protéomique fonctionnelle des cellules multiciliées – MCCproteome

Imagerie :

Les deutérosomes, qui ne mesurent que quelques centaines de nanomètres de large, nécessitent une imagerie très résolutive pour visualiser leur architecture. Pour imager les deutérosomes en microscopie à fluorescence, nous avons produit et validé des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre 3 protéines de xénope. Ces anticorps fonctionnent très bien en Western blot, ainsi qu’en marquage immunofluorescent d’embryons et dans notre lignée de MCC. Nous avons également utilisé la microscopie électronique en 2D (TEM) et 3D (SBF-SEM, tomographie), ce qui a permis de reconstruire les deutérosomes de xénope, dont la première et dernière image datait de 1969.

Au cours du projet, nous avons également établi le premier protocole fonctionnel de microscopie à expansion appliquée à l'embryon de xénope. Ce protocole permet une description avec une résolution inégalée de l'organisation fine des MCC, qui sera très utile au projets futurs de l'équipe.

Transcriptomique:

Afin de disposer des transcriptomes de référence de notre lignée inductible de MCC, le partenaire P1 a préparé des banques pour le séquençage en bulk à partir de cellules induites ou non, aux temps 0, 8h (début de différenciation), 24h (entrée en ciliogénèse) et 48h (MCC matures). Ces jeux de données permettent de comparer la dynamique de conversion transcriptome/protéome, et serviront de référence pour les projets futurs qui découlent du projet MCCproteome.

Protéomique:

Les fractions protéiques issues de cultures induites ou non furent isolées dans le laboratoire P1. Typiquement chaque échantillon contenait l'extrait de 20 millions de cellules. Toutes les expériences ont été conduites en triplicat. L'analyse en spectrométrie de masse des fractions protéiques fut conduite par le partenaire P2, qui pilote une plateforme de protéomique à la pointe. Le traitement des données issues du spectromètre fut également réalisé par P2 (assignation des pics, enrichissement, dynamique temporelle).

Purification de deutérosomes:

Grâce au recrutement d'une biochimiste dans l'équipe P1 via les fonds ANR, nous avons pu adapter un protocole de purification de centrosomes par gradient de sucrose à notre lignée de MCC, ce qui a permis d'enrichir significativement certaines fractions en deutérosomes fonctionnels (centrioles en cours de formation retenus dans le protocole). Ces fractions ont été analysées en spectrométrie de masse par le partenaire P2.

Analyses fonctionnelles:

Nous avons tiré partie de la versatilité de l'embryon de xénope pour tester l'importance de certaines des protéines identifiées dans le protéome pour la différenciation des MCC. Pour cela nous avons appliqué une approche perte de fonction par microinjection d'antisens morpholinos. Par ailleurs, nous avons utilisé une approche pharmacologique présentant l'avantage d'être applicable à l'embryon, à la lignée de MCC et même à la culture de cellules épithéliales de trachées humaines.

Boutin et al JCB 2026

Dans cette étude, nous rapportons la création d’une lignée cellulaire MCC inductible et stable, dérivée de cellules épithéliales rénales A6 de xénope. Après induction par le régulateur Multiciline (MCI), la majorité des cellules A6-MCI se différencient de manière synchrone en MCC matures en 48 heures. Grâce à cette ressource, ainsi qu’à des anticorps spécifiques et à l’imagerie en super-résolution, nous avons caractérisé les deutérosomes de xénope, les plateformes permettant la synthèse massive de centrioles dans les MCC de vertébrés.

Nous avons réalisé un profilage protéomique détaillé tout au long de la différenciation, révélant des régulateurs jusqu’alors non caractérisés, et mettant en lumière un rôle critique de la kinase CDK7 dans la différenciation des MCC chez le xénope et l’homme. Ces travaux fournissent une ressource précieuse pour les études mécanistiques de la biologie des MCC et ouvrent des perspectives pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques contre les ciliopathies motiles.

Dussert et al., STAR Protocols

La microscopie par expansion de tissus (TissUExM) permet une imagerie en super-résolution en élargissant physiquement les échantillons biologiques. Ici, nous décrivons une procédure optimisée pour appliquer la TissUExM aux embryons de xénope. Ce guide étape par étape couvre toutes les étapes clés du processus TissUExM, y compris la fixation des tissus, l’inclusion, le marquage fluorescent et l’expansion. Nous démontrons que notre protocole offre une résolution améliorée pour l’étude de structures subcellulaires, telles que les centrioles et les cils. Ce protocole est simple et robuste, et pourrait offrir un large éventail d’applications pour décrypter l’organisation subcellulaire dans les embryons de xénope.

Schirmer et al., en préparation

Grâce à l'adaptation d'un protocole de purification de centrosomes, nous avons pu enrichir certaines fractions en deutérosomes et les soumettre à la spectrométrie de masse. Nous avons produit deux types d'échantillons, des deutérosomes issus de MCC contrôles et des deutérosmes issus de MCC dans lesquelles la kinase PLK4, nécessaire à la synthèse centriolaire, fut inhibée. Dans le second cas, les deutérosomes ne sont pas chargés en centrioles en cours de synthèse, ce qui pourrait permettre de retenir plus spécifiquement les protéines constituant le deutérosome.

Boitel et al., soumis

www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.03.20.713242v1

Afin de confirmer la pertinence du crible deutérosome, nous avons analysé la fonction de Cspp1, une protéine associée aux microtubules. Le knockdown dans l'embryon de xénope cause une altération sévère de la production des centrioles et de la ciliogenèse. De manière cruciale, les deutérosomes ne se forment pas correctement en l’absence de Cspp1, confirmant son importance dans l’assemblage de cet organite. Ce rôle est conservé dans les MCC trachéales de souris (collab. équipe Firat-Karalar, Istamboul).

Les perspectives immédiates sont la finalisation et la soumission pour publication de l'étude concernant l'analyse protéomique du deutérosome. L'étude protéomique est finie; pour la dernière étape il s'agit de consolider et comparer les listes détaillées des protéines dans les fractions contrôle et PLK4-, ce qui permettra de déterminer si oui ou non la fraction PLK4- est débarrassée des composants du centriole. Si c'est le cas, nous pourrions avoir obtenu une fraction très enrichie en protéines spécifiquement deutérosomales, ce qui serait un tour de force dans le domaine.

A moyen terme, nous allons poursuivre l'exploitation de la ressource MCC inductibles en culture pour notamment étudier plus avant la fonction de la kinase CDK7, que nous avons identifiée dans le projet MCCproteome. Celle-ci présente plusieurs intérêts distinctifs. Son inhibition bloque totalement la synthèse des centrioles et des cils chez le xénope et l'homme, le phénotype le plus sévère que nous ayons jamais observé. Ceci suggère que CDK7 occupe une position très amont dans la cascade d'évènements qui président à la construction des MCC. Par ailleurs, CDK7 agit à la fois comme une kinase et comme un régulateur de la transcription, ce qui pourrait en faire un régulateur multipotent intégrant plusieurs niveaux de contrôle. Enfin, CDK7 est impliqué dans le cancer et certains inhibiteurs sont entrés en phase clinique. Nous allons donc solliciter des fonds (cancéropole PACA/ARC/LNC) pour engager un projet dans lequel nous proposerons d'analyser le transcriptome, le protéome et le phosphoprotéome des MCC en culture en présence ou non d'inhibiteurs contre CDK7.

De manière plus générale, les jeux de données produits grâce au projet MCCproteome vont fournir à notre équipe et à la communauté internationale une collection unique pour découvrir de nouveaux acteurs impliqués dans la biologie des MCC.

Nous avons été contactés par un laboratoire américain, expert dans l'identification d'interactomes à grande échelle pour exploiter notre lignée inductible de MCC. L'idée serait donc d'appliquer leur protocole afin d'identifier l'ensemble des interactions protéine-protéine à chaque étape clé du développement des MCC.

Le projet MCCprotéome vise à comprendre comment les cellules multiciliées (MCC) sont construites, une question très importante pour la santé humaine. Les MCC abritent des myriades de cils mobiles qui battent de façon coordonnée pour générer des flux directionnels de fluides biologiques ou pour déplacer des particules et des cellules à la surface de tissus épithéliaux spécialisés. Chez l'homme, les MCC sont impliqués dans la circulation du liquide céphalorachidien dans le système nerveux central, dans le transport des gamètes et dans l'évacuation du mucus souillé des voies aériennes. Il a été démontré que des mutations dans des gènes nécessaires à la formation de cils multiples sont responsables de syndromes familiaux caractérisés par des infections chroniques des voies respiratoires et un risque élevé d'infertilité. La gravité de ces symptômes souligne l'importance d'étudier les principes fondamentaux de la biologie des MCC.

Ces dernières années, le transcriptome global des MCC a été décrypté dans le xénope, la souris et l’homme. Il est maintenant temps d'élucider le protéome fonctionnel des MCC, ce qui est l'objectif principal de ce projet.

La ciliogénèse s'amorce lorsqu'un centriole migre sous la membrane cellulaire, s’ancre à un échafaudage à base d'actine et se transforme en un corps basal, qui agit comme une structure organisatrice de microtubules nécessaire à l'extension de l’axonème. Dans le cas de la multiciliogénèse, une étape supplémentaire clé consiste en une augmentation massive du nombre de centrioles après la sortie permanente du cycle cellulaire. Notre projet vise à faire la lumière sur cette étape, qui est propre aux MCC et encore mal comprise.

Chez les MCC des vertébrés, la biogénèse massive des centrioles se produit autour de plates-formes mal caractérisées, appelées deutérosomes, bien qu'une modeste multiplication à partir des centrioles parentaux ait également lieu. Les deutérosomes ont été décrits il y a cinquante ans par microscopie électronique comme des structures globulaires non centriolaires. Un premier composant du deutérosome, appelé Deup1, a été identifié en 2013. Des travaux récents dans l'équipe Kodjabachian ont identifié la Péricentrine et la ?-Tubuline comme composants supplémentaires du deutérosome. Ces études ont ouvert la voie à une caractérisation moléculaire et fonctionnelle plus poussée des deutérosomes, ce qui est l'objectif primordial de notre projet.

Nous utiliserons trois paradigmes expérimentaux pour étudier la biologie du deutérosome. i. L'épiderme embryonnaire du xénope, qui est couvert de MCC fonctionnelles 24h après la fécondation, et représente un modèle puissant et simple pour étudier la multiciliogénèse in vivo. ii. Une lignée cellulaire inductible de xénope nouvellement établie, qui fournit des populations homogènes et synchronisées de MCC. iii. Les MCC des parois épendymaires de la souris post-natale, bien adaptées à l'imagerie fluorescente in vivo et pouvant être manipulées par électroporation. Nous utiliserons une combinaison de microscopie fluorescente à super-résolution, de microscopie électronique 2D et 3D, de protéomique et de manipulations fonctionnelles pour étudier la composition moléculaire, l'architecture et l'activité des deutérosomes.

Jusqu'à présent, très peu d'études ont porté sur la biologie du deutérosome au niveau moléculaire. Grâce à ce projet, notre consortium est prêt à apporter d'importantes contributions dans ce domaine. En ce qui concerne sa pertinence pour la santé humaine, ce projet pourrait aider à identifier des gènes candidats potentiels pour des maladies causées par une réduction de la multiciliogénèse.