Une approche de chimie/biologie pour des analogues innovants de la granulysine – GRAN

L’assemblage de cette protéine de grande taille a été rendu possible par l’utilisation des réactions de ligation chimique native (NCL) et de ligation SEA, ainsi que de catalyseurs séléniés innovants. La synthèse de la 15-GN développée se déroule en quatre étapes dont deux sont réalisées en un seul pot. La stratégie implique trois étapes de purification au total pour accéder au polypeptide linéaire.
L’activité biologique des protéines ainsi produites est étudiée au travers de tests de chimiotaxie, de sécrétion de chimiokines et d’activité antibactérienne sur différentes souches bactériennes.

Le polypeptide linéaire obtenu a été replié dans un tampon phosphate à pH 7,4, en présence d’un mélange de glutathion oxydé et de glutathion réduit (GSH 1 mM / GSSG, 0,2 M). L’analyse LC-MS de la protéine formée dans ces conditions montre la présence de deux formes repliées, 15-GN-f1 (majoritaire) et 15-GN-f2 (minoritaire). L’analyse protéomique de 15-GN-f1 a révélé que le patron de ponts disulfures (Cys69-Cys132, Cys96-Cys107) présent dans le domaine saposine était conservé. Un autre pont disulfure a aussi été détecté entre les résidus Cys43 et Cys45 tandis que le résidu Cys138 est lié à une molécule de glutathion par disulfure mixte. La forme minoritaire, 15-GN-f2 présente également les deux ponts stabilisants le domaine saposine mais une des deux cystéines de l’extrémité N-terminale (Cys43 ou Cys45) est liée à une molécule de glutathion tandis que la Cys138 est non appariée.
La même stratégie a été employée pour accéder à différents analogues de la 15-GN qui ont également été analysés pour identifier la nature des ponts disulfure formés.
L’ensemble de ces protéines a fait l’objet d’études pour quantifier leur pouvoir chimioattractant et leur activité antibactérienne. Un analogue biotinylé a permis d’initier l’identification du récepteur à la granulysine.

Les principales perspectives de ce travail sont: 1) l'identification d'un analogue de granulysine ayant une structure bien définie et présentant les propriétés biologiques de la granulysine sauvage. 2) l'identification du récepteur de la granuysine impliqué dans l'activité chimiotactique

An alkylselenol catalyst for chemical protein synthesis
Florent Kerdraon, Gemma Bogard, Benoît Snella, Hervé Drobecq, Muriel Pichavant, Vangelis Agouridas, Oleg Melnyk, 2021, submitted

Cargoët, M.; Diemer, V.; Snella, B.; Desmet, R.; Blanpain, A.; Drobecq, H.; Agouridas, V.; Melnyk, O. Catalysis of Thiol-Thioester Exchange by Water-Soluble Alkyldiselenols Applied to the Synthesis of Peptide Thioesters and SEA-Mediated Ligation. J. Org. Chem. 2018, 83, 12584–12594.

La granulysine (GN) est une protéine humaine sécrétée par les lymphocytes T et les cellules NK. La protéine GN a une activité antimicrobienne assez large (bactéries Gram positif et négatif, champignons, parasites) ainsi que des propriétés immunomodulatrices. Grâce à l’expertise du coordinateur (O. Melnyk, CIIL, équipe CBF, Lille) en synthèse chimique des protéines et en biochimie, et celle de M. Pichavant (CIIL, équipe Li3, Lille) en immunologie pulmonaire, nous voulons réaliser une étude de relation structure-activité pour la protéine GN et progresser dans le mécanisme d’action de cette protéine en identifiant le ou les récepteurs impliqués dans ses activités. Les analogues de la GN ayant une forte activité et une meilleure stabilité seront testés dans un modèle murin d’infections pulmonaire par trois bactéries différentes.
L’utilisation de la synthèse chimique dans ce projet est justifiée par la grande difficulté rencontrée dans la production de cette protéine cytotoxique par les techniques recombinantes classiques. De plus, des contradictions dans la littérature sont dues probablement à l’hétérogénéité des protéines d’origine biologique et notamment à leur contamination potentielle par des éléments issus du système d’expression. Les protéines synthétiques sont dépourvues de tels contaminants. Ce projet repose sur des résultats préliminaires robustes obtenus à partir de protéine GN de haute pureté produite par synthèse chimique. En effet, un procédé efficace et modulaire a été validé pour la production de la protéine GN à l’échelle du milligramme. Le repliement de la protéine GN est maitrisé. Nous avons déterminé pour la première fois la nature des ponts disulfure formés durant le repliement. La protéine GN est active au bas nanomolaire dans un test de chimiotaxie utilisant des lymphocytes purifiés. Ce travail constitue donc une base solide et rationnelle pour la conception d’analogues optimisés.