Contôle chimique de l'autophagie – Autophagy

L’autophagie, qui peut être générale ou spécifique d’organites, joue un rôle fondamental dans la maintenance de l’homéostasie cytoplasmique, aussi bien au repos qu’en réponse au stress. Des dysfonctionnements de l’autophagie sont impliqués dans la neurodégénescence, les syndromes progeroïdes, l’oncogénèse et les maladies cardiovasculaires. L’autophagie est normalement étudiée suite à une déplétion de nutriments ou un traitement par des agents pharmacologiques qui normalement ont d’autres effets additionnels sur la physiologie cellulaire. En plus, ces traitement n’induisent pas l’autophagie simultanément dans toutes les cellules et ne sont pas capables d’induire une autophagie qui atteint vraiment seulement un seul type d’organites, ce qui rend difficile l’interprétation des données. Ici, nous proposons de construire un système de manipulation expérimentale de l’autophagie entièrement nouveau.
Pour cela, nous générerons des instruments de chimie biologique (Tache 1) qui impliquent des systèmes génétiques inductibles pour stimuler l’autophagie. Les cellules seront stablement transfectées par une recombinase Cre inductible par le tamoxifène (Cre-ERT2), plus, en aval d’une cassette Lox-Stop-Lox, un vecteur polycistronique exprimant ATG5 et LC3 qui est fusionné dans son N-terminus avec le domaine ‘streptavidin binding peptide’ (SBP). De plus, les cellules seront transfectées avec un gène codant pour la streptavidine dirigé vers la surface de différentes organites comme les centrosomes (fusion avec centrin-2), le réticulum endoplasmique (CD47/Ii), les mitochondries (TOM20), la membrane nucléaire (domaine KASH), les peroxysomes (PEX3), la membrane plasmique (KRAS) et les ribosomes (RPL11). Dan ce système l’autophagie spécifique des organites peut être contrôlée à deux niveaux : (i) en ajoutant le tamoxifène pour induire l’expression d’ATG5 et de la protéine de fusion SBP-LC3 et (ii) en rajoutant ou enlevant la biotine ou un mimétique réversible de la biotine (AliS-1) qui empêche l’interaction entre SBP-LC3 et la streptavidine localisée dans différentes organites, ce qui permettra donc d’induire et d’inhiber l’autophagie à volonté. Des instruments optogénétiques suivant des stratégies similaires seront également générés (Tache 2).
Ces systèmes expérimentaux seront utilisés pour étudier la cinétique et la biochimie de l’autophagie spécifique des organites (Tache 3), in vitro, dans les cellules humaines cultivées et in vivo, dans les cellules transplantées chez l’animal, ainsi que dans les souris transgéniques. La purification des autophagosomes et des lysosomes (possible grâce à l’expression de LC3 ou de LAMP2 portant un ‘tag’ HA, permettant l’immunopurification de vésicules positive pour HA) suivi par l’analyse par spectrométrie de masse des produits de dégradation fournira des connaissances fondamentales sur le processus autophagique et son impact sur le métabolisme cellulaire. Des procédés de biotinylation locale seront également développés pour éviter le fractionnement subcellulaire.
La technologie que nous développerons permettra de générer des cellules dépourvues de certaines organites (p.ex. des centrosomes, mitochondries, peroxysomes…) et donc d’étudier (Tache 4) les conséquences fonctionnelles d’un type unique de « organellar knockout » (ou dans le cas d’une déplétion partielle « organellar knockdown »). Cette approche fournira des connaissances de base sur la contribution des organites à l’organisation cellulaire, au procéssus de signalisation et au métabolisme. De plus, nous pourrons définir comment l’autophagie de certaines organites améliore la ‘fitness’ cellulaire (in vitro), la santé globale (in vivo) ou au contraire provoque la mort cellulaire.
Etant donné l’importance physiopathologique de l’autophagie, ces résultats contribueront à la découverte de nouveaux biomarqueurs et procédures thérapeutiques.