Voies de sauvetage pour les ribosomes non recyclés – Rescue_ribosome

Tâche 1: Identification des facteurs de trans- impliqués dans le sauvetage des 3’-Ribosomes (Équipe 1 et Équipe 2).
Nous effectuerons plusieurs types de cribles génétiques et d’approches biochimiques afin de sélectionner de nouveaux candidats potentiellement impliqués dans le sauvetage des ribosomes. Un crible de surexpression avec un gène rapporteur spécifique sera mené par l’équipe 1 (tâche 1-1). L'équipe 2 utilisera également ce gène rapporteur spécifique pour cribler la collection de mutants de délétion et une bibliothèque de mutants hypomorphes de gènes essentiels. L'équipe 1 utilisera ce rapporteur pour sélectionner directement des cellules mutagénisées de manière aléatoire (tâche 1-2). L’Équipe 2 prévoit également d’effectuer un crible de létalité synthétique (tâche 1-3), ainsi que l’identification par spectrométrie de masse (tâche 1-4) et un crible double hybride (tâche 1-5).
Tâche 2: Identification des facteurs agissant en cis (Équipe 1 et Équipe 2)
Les motifs d’ARNm susceptibles de jouer un rôle dans la dissociation dees ribosomes 3 ’ seront recherchés à partir des données de ribosome profiling. Les motifs sélectionnés seront validés à l'aide d'un gène rapporteur dédié (tâche 1).
Tâche 3: Caractérisation fonctionnelle (Équipe 1 et 2)
Nous prévoyons d’appliquer plusieurs approches à l’échelle du génome afin d’obtenir une vue complète des 3'-ribosomes et de déchiffrer la fonction moléculaire des nouveaux facteurs que nous aurons identifiés. Nous identifierons les cibles ARN à l’aide de la méthodologie CRAC (tâche 3-1, équipe 2) et nous essaierons d’obtenir une image complète de l’état de la traduction de la cellule par Ribosome Profiling (tâche 3-2, équipe 1).

Il n'est pas possible de les rendre public actuellement.

Les perspectives doivent rester pour le moment confidentielles

1. Blanchet S. et al. PNAS 2018 (partenaire 1)
2. Planchard N. et al Nucl. Acids. Res. 2018 (partenaire 1)

L’homéostasie des protéines, essentielle pour la cellule, fait intervenir de nombreuses étapes de contrôle et régulations. Elle nécessite le maintien d’un pool de ribosomes actifs et également un contrôle qualité des ARN messagers et des peptides produits. Ces deux évènements sont liés aux dernières étapes de la traduction, terminaison et recyclage, qui consistent à relarguer le peptide naissant et à dissocier les deux sous-unités de manière à recycler les ribosomes. L’intégrité des messagers est contrôlée à cette étape de la traduction. Si le messager est «conforme», la terminaison va s’effectuer à l’aide des facteurs de terminaison eRF1 et eRF3 et du facteur de recyclage Rli1. Dans les cas de messagers défectueux, tels que des messagers sans stop (Non-Stop mRNA decay-NSD) ou qui, pour diverses raisons, vont ralentir ou bloquer le ribosome (No-Go mRNA decay-NGD), des paralogues d’eRF1 et eRF3, Dom34 et Hbs1, assistés de Rli1 vont intervenir pour dissocier et recycler les ribosomes bloqués. Il semblait donc difficilement imaginable de trouver des ribosomes dans les régions 3’ non-traduites (3’UTR).
Cependant, il a récemment été montré que, lors d’un défaut de recyclage des ribosomes ceux-ci pouvaient se retrouver dans les 3’UTR. Ces résultats indique également que des ribosomes sont présents dans les 3’UTR dans un contexte sauvage. Il y a deux possibilités pour libérer ces ribosomes-3’UTR: i) soit ils ré-initient la traduction et dans ce cas, la traduction se terminera de manière classique avec l’intervention d’eRF1 et eRF3 ; ii) soit ces ribosomes seront dissociés par les facteurs Dom34/Hbs1 comme dans le cas de NSD/NGD. La découverte de ces ribosomes non-recyclée est très récente et ouvre un champ de recherche très prometteur.
Le but de ce projet est de caractériser la nature des ribosomes présents dans les 3’UTR et de comprendre pourquoi certains vont ré-initier la traduction et d’autres pas.
La première partie de ce projet va consister à identifier les facteurs intervenant dans ce processus. Ceci va être réalisé par des cribles génétiques (avec des gènes rapporteurs adaptés, des cribles de surexpression, de léthalité synthétiques et double-hybride). Ensuite, ces facteurs seront utilisés pour réaliser des purifications par affinité afin d'identifier leurs partenaires.
Nous avons déjà identifié deux facteurs jouant un role dans cette voie. L’un d’eux, une RNA hélicase de fonction inconnue, que nous avons appelé Tac4 (Translation Associated Component 4) est associé aux polysomes et présent dans les 3’UTR. Ces résultats préliminaires montrent la faisabilité du projet.
Des résultats suggèrent que des motifs ARN dans les 3’UTR pourraient avoir un rôle dans la dissociation et le sauvetage des ribosomes. Nous projetons d'identifier les éléments agissant en «cis» responsables de ce phénomène. Leur caractérisation sera réalisée par la combinaison d’expériences utilisant des rapporteurs adéquates et une analyse bioinformatique à partir des séquences/structures sélectionnées.
Par ailleurs, des approches génomiques vont être effectuées. Le CRAC (dérivée de la méthode de CLIP-seq) ou des expériences de RIP-seq nous renseigneront sur les cibles spécifiques de ces complexes ou facteurs. Enfin, le ribosome profiling nous donnera une image de l’état traductionnel des ribosomes associés à ces facteurs particuliers.
Bien que ce projet soit un projet de recherche fondamental, nos résultats devraient aussi avoir un impact sur la compréhension des ribosomopathies. En effet, l’accumulation des ribosomes en 3’UTR va perturber l'homéostasie du ribosome et entrainer ce que l'on appelle des ribosomopathies. Ces maladies, cliniquement distinctes, sont toutes liées à un défaut dans l'homéostasie du ribosome. Certaines entrainent une réduction du nombre de globules rouges, alors que d'autres entrainent des défaut du squelette et des retards de croissance.